低氧联合NaCl胁迫下蚕豆发芽富集γ-氨基丁酸培养条件优化*

杨润强，陈惠，顾振新

(南京农业大学食品科技学院，江苏南京，210095)

低氧联合NaCl胁迫下蚕豆发芽富集γ-氨基丁酸培养条件优化*

杨润强，陈惠，顾振新

(南京农业大学食品科技学院，江苏南京，210095)

以蚕豆(启豆2号)为原料，研究了低氧联合NaCl胁迫下培养条件对γ-氨基丁酸(GABA)富集的影响。结果显示:非胁迫培养时间、培养pH和胁迫培养时间显著影响发芽蚕豆GABA积累。蚕豆发芽富集GABA最佳培养条件是非胁迫培养1.5 d、培养液pH 3.5和低氧联合NaCl胁迫4 d，在此条件下其GABA含量可达1.06 mg/g DW，为原料蚕豆的7.57倍。

蚕豆，发芽，γ-氨基丁酸，富集，低氧胁迫，NaCl胁迫

蚕豆富含蛋白质、淀粉、氨基酸、维生素和矿物质等，是人体良好的营养来源。发芽是改善豆类种子营养成分和降低抗营养因子的有效方法。发芽能提高豆类生理活性物质的含量，如发芽可提高蚕豆中 L-二羟苯丙氨酸(L-DOPA)和总酚[1］，尤其 γ-氨基丁酸(GABA)含量[2］。GABA是一种非蛋白质氨基酸，具有降血压、降血脂等生理功能。植物在热击、冷害、机械损伤、盐胁迫和低氧等逆境胁迫条件下，均能强烈激活谷氨酸脱羧酶(GAD)和二胺氧化酶(DAO)活性，促进GABA的合成[3］。低氧胁迫下，植物细胞中H+浓度提高，导致细胞质酸化，为GABA的合成提供了条件[4］。盐胁迫可使细胞中Ca2+浓度升高，促使钙调蛋白(CaM)表达水平提高，GAD被 Ca2+/CaM激活，从而促进 GABA积累[5］。本文采用低氧联合NaCl胁迫的方式处理发芽蚕豆，探讨了培养条件对蚕豆发芽富集GABA的影响。通过正交试验对培养时间、pH和胁迫时间进行优化，确定最佳培养条件，为开发功能性蚕豆食品提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

蚕豆品种:启豆2号，购自江苏沿江地区农业科学研究所。蚕豆种子于2011年收获后密闭保存于4℃下聚乙烯容器中，备用。

1.2 种子培养

称取一定量蚕豆，用蒸馏水清洗后，1%的次氯酸钠消毒30 min，蒸馏水洗净残留的次氯酸钠。于蒸馏水中30℃浸泡8 h，取出吸干表面水分，置于铺有2层纱布的托盘(长、宽、高分别为20 cm、15 cm和5 cm)中，上面覆盖2层湿纱布，于33±1℃避光培养。

1.3 试验设计

1.3.1 单因素试验

非胁迫培养:取30±2 g经8 h浸泡处理的蚕豆，置于铺有2层纱布的托盘(长、宽、高分别为20 cm、15 cm和5 cm)中，上面覆盖2层湿纱布，分别避光培养0、0.5、1、1.5、2、2.5 和3d 后，测定 GABA 含量。

pH:取30±2 g经前期培养的蚕豆，置于具塞培养瓶中，加入 pH 值分别为 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和 6.5 的 60 mmol/L NaCl溶液 250 mL，参考 Li等[6］的方法[(33 ±1)℃，通气量为 1.2 L/min］避光培养4 d。

胁迫培养:取30±2 g置于具塞培养瓶中，加入含有60 mmol/L的NaCl溶液的柠檬酸缓冲液(pH 3.5)，于(33 ±1)℃下低氧胁迫 0、1、2、3、4、5 和6d。

1.3.2 复因素试验

以培养时间、胁迫时间和pH为3个影响因素，各取3水平，进行L9(34)正交试验，研究发芽蚕豆中GABA含量变化，试验设计与结果见表。

游离氨基酸:采用水合茚三酮显色法测定[8］。

1.4 GABA含量测定

1.4.1 GABA提取和样液制备

称取1.0 g鲜重的发芽蚕豆于研钵，加5 mL 7%的乙酸研磨成浆。按照Bai等[7］的方法对样品进行纯化。浆液静置提取1 h，6000 r/min离心15 min取上清液，加入5 ml无水乙醇，在0～4℃放置2 h，以沉淀多糖和杂蛋白;之后6000 r/min离心20 min。上清液在0.1 MPa，45℃条件下真空干燥，残余物溶于2 mL1M NaHCO3(pH 9.0)缓冲溶液，4000 r/min离心10 min，上清液备用。

1.4.2 测定方法

GABA测定采用高压液相色谱HPLC(Agilent 1200，USA)，色谱柱为 ZORBAX Eclipse AAA reversed-phase column(3.5 μm)，4.6×150 mm，条件参照Yang等[8］的方法。取1 mL(pH 9.0)氨基酸溶液，加入2 mg/mL的二甲氨基苯磺酰氯的丙酮溶液1 mL，于67℃ 保温10 min后用冰浴终止反应，然后使用DAD检测器于425 nm紫外检测。流动相A为乙睛，流动相B为0.045 M CH3COONa(pH 4)缓冲液，上样量为20 μL，流速为1 mL/min，分离时间30 min，柱度30℃。

1.5 数据统计与分析

试验设3次重复，结果换算成干基重，以平均值±SD表示，数据采用SPSS(18.0)软件处理，设置显著性水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 培养条件对发芽蚕豆富集GABA的影响

2.1.1 培养时间

如图1所示，随非胁迫培养时间的延长，蚕豆中GABA含量呈先增加后减少的趋势，培养1.5 d时，发芽蚕豆中GABA含量达到最大值(1.02 mg/g DW)，为0 d的3.43倍。因此，选择培养时间1.5 d为后续试验的非胁迫培养时间。

图1 培养时间对发芽蚕豆GABA含量的影响

2.1.2 培养液pH值

由图2可知，随着发芽蚕豆培养液pH值的升高，GABA含量呈先下降后上升的变化趋势。培养液pH值为3.0时，蚕豆GABA含量最高;但由于此pH条件下蚕豆发芽率很低，蚕豆生命活动很弱，从而容易腐烂或有异味。因此，选择pH值3.5作为后续试验缓冲液pH值。

图2 pH对发芽蚕豆GABA含量的影响

2.1.3 胁迫时间

胁迫时间对GABA含量的影响见图3。GABA含量随胁迫时间的延长先逐渐增加后趋于平衡。当胁迫4 d时，GABA含量达到最大值(1.02 mg/g DW)，此后，其含量趋于平衡。因此，选择4 d为后续试验所需的胁迫时间。

图3 胁迫时间对发芽蚕豆GABA含量的影响

2.2 培养条件优化

选取单因素试验得到的发芽蚕豆富集GABA最佳培养时间、培养pH和胁迫时间为中间值，以培养时间(0.5 d、1.5 d和 2.5 d)、培养 pH(3.5、4.0 和4.5)和胁迫时间(2 d、4 d和6 d)进行3因素3水平正交试验，实验结果见表1。

表1极差分析结果表明，各因素对发芽蚕豆中GABA含量影响的主次顺序为C、A、B，即培养胁迫时间＞培养时间＞pH。比较各水平的K值可知，发芽蚕豆富集GABA的最佳培养条件为A2B1C2，即培养时间1.5 d、培养pH 3.5和胁迫时间4 d(表中第4组)。

表1 L9(34)正交实验结果

3 讨论

植物受到低氧、冷激、干旱、盐胁迫和机械伤害等逆境胁迫时，体内GABA含量显著增加[9］，其中低氧和盐胁迫是富集GABA最安全有效的方法。但由于低氧和盐胁迫均为逆境，若直接将植物种子置于其中，势必长势不佳，因此最有效的方法是先将植物种子正常培养一段时间，之后置于低氧和盐胁迫等逆境中进行胁迫培养。因此，本研究采用此培养方法研究低氧联合NaCl胁迫下培养条件对蚕豆GABA富集的影响。

植物中GAD的最适反应pH值通常在5.5～6.0之间[10］，说明植物体内GAD在微酸性环境下活性高。Carroll等[11］研究表明，酸性环境激活了胡萝卜细胞的GAD活性，导致GABA积累，当胞质pH恢复正常后GAD活性降低。Crawford等[12］研究发现，外源加入透膜性弱酸15 s后，芦笋叶肉细胞出现GABA的积累。这些实验为植物细胞质pH值变化影响GABA合成提供了证据。由于植物体内L-Glu脱羧，造成反应体系pH升高，偏离了GAD的最适pH，使GABA富集速度下降。将反应置于缓冲体系中，可以稳定反应的pH值，提高GABA产量。白青云[13］研究表明，缓冲液类型影响GABA富集，柠檬酸缓冲液培养的粟谷生长情况良好，而醋酸缓冲液粟谷芽生长受到抑制。粟谷富集GABA的最适pH值为5.8，与GAD的最适pH值相近。李岩[6］则采用pH 3.19的柠檬酸-磷酸缓冲液富集蚕豆GABA。本研究选择更安全可靠的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液进行GABA的富集研究。结果表明，培养pH 3.5时，蚕豆生长良好，GABA的富集量达到1.02 mg/g DW。此pH值明显低于大豆(pH 4.1)[14］、糙米(pH 5.6)[15］和粟谷(pH 5.8)[16］。这是由于蚕豆子叶厚实、籽粒较大，因此外界环境中pH值必须足够低才能维持体内低pH条件。

4 结论

低氧联合NaCl胁迫下，培养时间、培养pH和胁迫时间显著影响发芽蚕豆GABA积累，并且三者对GABA含量影响的顺序是:培养pH＞培养时间＞胁迫时间。

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ABSTRACTThe culture condition of γ-aminobutyric acid accumulation in germinating fava bean(Qi Bean 2)seeds under hypoxia combined with NaCl was investigated.The results showed that non-stress culture time，pH and stress time impacted the accumulation of GABA significantly.The optimum condition was culturing for 1.5 days，pH 3.5 and stress for4days.The GABA content was 1.06 mg/g DW and was 7.57-fold of that in un-germinated fava bean.

Key wordsFava bean，germination，γ-aminobutyric acid，accumulation，hypoxia stress，NaCl stress

The Optimization of Culture Condition on γ-aminobutyric Acid Accumulation in Fava Bean(Vicia faba L.)Under Hypoxia Combined with NaCl

Yang Run-qiang，Chen Hui，Gu Zhen-xin
(Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China)

博士研究生(顾振新教授为通讯作者，E-mail:yuzx@njau.edu.cn)。

*国家自然科学基金(31071581);中央高校科研业务费专项基金(KYZ200917);江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)

2012-03-21，改回日期:2012-05-04