丙烯酰胺对大鼠肝脏P4502E1活力的影响

张海明，张丽

（1．山西农业大学 信息学院，山西 太谷030800；2．太原市星火技术发展中心，山西 太原030009）

丙烯酰胺（acrylamide，Acr）具有毒性和潜在的致癌性，食品中丙烯酰胺的存在及食用安全性引起了社会的高度重视［1，2］。目前，丙烯酰胺的研究主要对其毒性进行试验，包括一般毒性、神经毒性、生殖毒性、致癌性等。Acr进入机体主要通过诱导P4502E1，然后代谢为GA或者与谷胱甘肽结合形成N－乙酰基－S－半胱氨酸及其硫氧化物，进一步在体内各个组织器官作用产生毒性［3～6］。因此，研究Acr的代谢机制是研究其毒性的关键。但丙烯酰胺在体内的代谢过程仍不十分清楚，Acr在代谢生成GA的过程中，GA的生成量与Acr的摄入剂量是否有关，不同剂量下它的作用机制是否相同也不十分清楚。为更深入地了解丙烯酰胺的代谢机理以及毒性机制，以Sprague－Dawley雄性大鼠为试验动物，随机分组进行丙烯酰胺染毒试验，来观察Acr对大鼠肝脏P4502E1的影响。

1 材料

试验动物：

清洁级Sprague－Dawley大鼠（雄性）80只，体重为180～220g，鼠龄50d。

80只大鼠随机分为低、中、高3个剂量组和1个对照组，采用腹腔注射法，染毒剂量分别设为0、25、50、100mg·kg－14个等级，染毒时，按蒸馏水与Acr等体积配成不同浓度用的稀释液，对照组用等体积的生理盐水替代。实验过程中隔日染毒，持续时间为12周。

分别在第3、6、9实验周的末次染毒4h后，各组随机抽取4只大鼠处死，取出肝脏并用预冷的生理盐水冲洗，然后用滤纸吸干，切小块后置于液氮罐中，在－70℃冰箱保存备用。

2 方法

取冻存的肝脏提取肝微粒体。取部分肝组织剪成碎块，用含 KCl（0．15mol·L－1）的磷酸缓冲液（0．1mol·L－1，pH＝7．4）进行多次冲洗以除掉组织中的血液成分，按1∶4（W／V）加入KCl－磷酸缓冲溶液，使用内切式组织匀浆机将组织制备成肝匀浆，用超速离心机将其离心（9000r·min－1）15 min，取上清液，进一步离心（10 000r·min－1）60 min，弃上清液所得到的粉红色沉淀即肝微粒体。将其悬浮于KCl－磷酸缓冲溶液（内含体积比为30%甘油），然后置于－120℃冰箱中，保存备用［7］。以上操作均应在低温冰浴中进行。

采用分光光度计测定P4502E1的活力。

3 结果与分析

从表1和图1中可以看出，P4502E1活力随染毒时间延长，有逐渐上升的趋势。在25mg·kg－1剂量组随染毒时间增加而酶活力升高，差异极显著（P＜0．01）。在50mg·kg－1、100mg·kg－1剂量组，大鼠肝脏P4502E1酶活力在染毒第6周表现出峰值现象。同一时间不同剂量组的比较发现，随剂量的增加酶活力增强，但在第12周以25mg·kg－1剂量组活力最高，差异极显著（P＜0．01）。

表1 Acr染毒大鼠肝微粒体P4502E1活力变化Table 1 P4502E1vigor in rat liver microsome to use narcotics with Acr

图1 不同剂量组P4502E1酶活力比较Fig．1 Compare of P4502E1enzyme activity in different doses

4 讨论

细胞色素是一类以铁卟啉（或血红素）作为辅基的电子传递蛋白，广泛参与动、植物，酵母以及好氧菌、厌氧光合菌等的氧化还原反应。细胞色素P4502El是细胞色素大家族的成员之一，在人肝脏中含量最丰富，并且富集于肝小叶中心区域，近年陆续发现在鼻腔、食道、胃、小肠、结肠、肺、肾、皮肤等许多肝外组织器官有不同程度的表达。细胞色素P4502E1主要负责小分子量物质如丙酮、乙醇、乙酸等及异烟肼、水杨酸类药物和亚硝胺、芳香族类致癌物的代谢，已确定为P4502E1的底物多达75种，其中大部分为前致癌物和前毒物，少部分为药物［6～9］。而这些底物对P4502E1又具有诱导作用。本实验结果显示，P4502E1活力随染毒时间延长，有逐渐上升的趋势，这与底物Acr对P4502E1的诱导作用有关。

Adler对显性致死性突变评价实验中，用1＿ABT（1＿ABT是P450酶的抑制剂）处理父本鼠，1＿ABT能抑制Acr代谢为GA，可降低显性致死性突变发生率。细胞色素氧化酶P450抑制剂1＿ABT可阻断丙烯酰胺经细胞色素P450的氧化代谢，导致人角质形成细胞DNA损伤明显下降。Sunmer等以13C标记的Acr染毒Fischer大鼠和B6C3F1小鼠，用核磁共振分析动物的尿代谢物，证实Acr在体内能通过与巯基加成而经谷胱甘肽代谢，在小鼠实验发现50%的丙烯酰胺在肝微粒体P4502E1作用下代谢成GA，后者可进一步和谷胱甘肽结合，在谷胱甘肽－S－转移酶作用下代谢清除或以原形排泄［3～5］，其转化率可能与体内丙烯酰胺的水平有关［10］。Calleman CJ等实验发现，以极低浓度母体化合物Acr腹腔注射大鼠，经代谢约有60%转化为GA［11］，对Acr暴露工人的血红蛋白加合物测定显示Acr在人体也转化为具有基因毒性的GA，且在低暴露水平下测得体内GA和Acr的剂量比为3∶10［12］。低剂量（25mg·kg－1）丙烯酰胺，体内环氧丙酰胺的转化率为51%，而高剂量（100mg·kg－1）时转化率13%［13］。在本实验结果中，整个攻毒过程中，酶活力会出现一个峰值，早期，随着攻毒时间的延长酶活力增加，出现峰值后逐渐降低，而且，在50、100mg·kg－1剂量组，酶活力峰值出现较25mg·kg－1剂量组早6周，高剂量组P4502E1活力较早出现降低，会使得GA转化率较早降低。由此可见，P4502E1在丙烯酰胺的代谢中是重要的代谢酶。

5 结论

P4502E1活力随染毒时间延长，有逐渐上升的趋势，但并不是一直上升，而是出现峰值后下降。在25mg·kg－1剂量组随染毒时间增加而酶活力升高，差异极显著。在50、100mg·kg－1剂量组，大鼠肝脏P4502E1酶活力均在染毒第6周表现出峰值现象。同一时间不同剂量组的比较发现，随剂量的增加酶活力增强，但在第12周以25mg·kg－1剂量组活力最高，差异极显著。

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