冷胁迫对棉苗抗氧化酶活性及丙二醛含量的影响

尹晓斐，姜艳丽，杨艳兵，王计平

（1．山西省农业大学 农学院，山西 太谷030801；2．山西省农业科学院 棉花研究所，山西 运城044000）

棉花（Gossypium spp．）是锦葵科棉属植物，原产于亚热带，喜热、耐旱、好光、忌渍，最适在疏松深厚的土壤中种植。我国主要分布在西北内陆棉区、黄河流域棉区和长江流域棉区。棉花同其他喜温作物一样在整个生长发育过程中，最适宜的温度为20～30℃，低于或高于此范围，则不能正常生长发育，当日平均温度低于15℃时就会对植物生长发育造成一定的影响［1］。低温伤害可发生于棉花的任何生育时期，从种子吸胀到萌发，从幼苗生长到开花盛铃，直至影响到棉花的产量。近年来，我国北方大部分棉区经常发生倒春寒，导致棉花幼苗遭受冷害，造成大面积病苗和僵苗，给棉花生产带来严重损失［2，3］。本试验以5个不同熟性棉花品种的幼苗作为研究材料，分析低温处理下的POD活性、SOD活性和MDA含量变化，以此评价不同棉花品种幼苗对低温胁迫的抵抗能力，为棉花抗冷性育种的室内筛选提供一定理论依据。

1 材料与方法

1．1 试验材料

试验于2011年在山西农业大学植物生理学实验室进行，供试棉花为早熟品种N52，中熟品种N177和N181，晚熟品种N203和K－1。选择籽粒饱满的棉花种子，用浓硫酸进行脱绒处理3 min，然后将种子用清水冲洗3～5次，3mg·L－1赤霉素溶液浸泡12h，然后将种子放入28℃培养箱中待棉花种子萌发。萌发后的种子移至育苗盆进行育苗，25℃光照培养两周，当植株长出两片真叶时选取生长一致的幼苗进行4℃冷处理，每个品种处理1d、2d、3d后取样，分别测定SOD、POD活性和MDA含量。

1．2 试验方法

1．2．1 过氧化物酶POD活性的测定

愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性［4］。过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，在470nm波长处，通过测定溶液的光密度值可以计算过氧化物酶的活性大小。取0．1g新鲜植物材料加入1mL 0．1M磷酸缓冲液pH6．0（分两次加入），在冰上研磨成匀浆，研磨后转入1．5mL离心管中，在4℃下以12 000 r·min－1离心15min。上清液即为酶提取液。比色：（以0．1M 磷酸缓冲液pH 6．0为参照）：在比色杯中加入上清酶液100μL，再加入反应液3mL，立即准确计时，在测定波长为470nm处，反应3 min后测定光密度值。

△A为3min前后吸光值的变化；Vt为酶液总体积；Vs为测定时所用酶液总量；t为反应时间；W 为样品鲜重。

1．2．2 超氧化物歧化酶SOD活性测定

NBT光化还原抑制法测定SOD活性［5］。取0．1g植物材料，置于研钵中，加入1mL50mM pH7．8磷酸缓冲液，在冰上研磨成匀浆，用1mL磷酸缓冲液冲洗，合并于2mL离心管中。在4℃条件下12 000r·min－1离心15min，上清液即为SOD粗提液。取上清液50μL于透明度较好的试管中，加入5mLNBT反应液（13mmol·L－1甲硫氨酸，63μmol·L－1氮蓝四唑，1．3μmol·L－1核黄素，0．1mmol·L－1EDTA，均用0．05mmol·L－1pH7．8磷酸缓冲液配制），在25℃下4000lx日光灯下照光20min，在560nm测定吸光值，不加酶液的（补充0．1mL的50mmol·L－1pH7．8磷酸缓冲液）为对照，避光保存的为参比。SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。

ACK为光对照管的吸光值；AE为样品管的吸光值；V为酶提取液的总体积；VT为测定时所用的酶液体积；W 为样品鲜重（g）。

1．2．3 丙二醛（MDA）含量测定

硫代巴比妥酸法测丙二醛含量［6］，称取剪碎的试材0．4g，加入2mL 0．1%TCA 和少量石英砂，研磨至匀浆，再加3mL 0．1%的TCA分两次冲洗研钵，合并提取液，每个样品做两个重复。在提取液中加入5mL0．5%的硫代巴比妥酸溶液，摇匀将试管放入沸水浴中显色反应15min后立即放入冰水浴中冷至室温冷却后转入10mL离心管中3000 r·min－1离心15min，取上清液并测量体积，以0．5%的硫代巴妥酸溶液为参照，测532nm、600 nm波长下的吸光值。

A532、A600为532nm和600nm处得吸光值；V为上清液总体积；155为1nmol·L－1三甲川在532nm的吸光系数；W 为称取植物材料的鲜重。

1．3 数据分析和统计

采用Excel软件完成数据整理和计算，用DPSV7．05软件进行统计分析，P＜0．05表示差异显著，P＜0．01表示差异极显著。

2 结果与分析

2．1 4℃处理对不同品种棉花幼苗过氧化物酶活性的影响

POD和SOD均是膜保护酶系统中的主要成员，酶活性越高，保护生物膜的作用就越强，抵御冷害的能力也就越强。由图1可见，5个品种的POD活性均呈现先上升后下降的趋势。其中早熟品种N52、中熟品种N181在胁迫处理第1天POD活性有显著升高，随后酶活性开始下降，在处理第3天酶活性分别比对照降低了13．3%和51．9%；中熟品种N177和晚熟品种K－1在冷处理前两天POD活性变化极显著（P＜0．01），分别为对照的239．9%和145．6%，但2天后酶活性开始降低；晚熟品种N203在胁迫处理中POD活性变化不大，在处理2天后酶活性比对照降低了的4．4%；总体来看，5个品种在低温处理过程中，POD活性均比对照有所升高，其中中熟品种N177变化最为显著。

图1 冷处理对棉花幼苗中过氧化物酶（POD）含量的影响Fig．1 The effect of low temperature on POD activity

2．2 4℃处理对不同品种棉花幼苗超氧化物歧化酶活性的影响

由图2可见，在4℃低温处理下，5个棉花品种幼苗的SOD酶活性变化规律基本相同，均随处理时间的延长而增加，尤其在低温处理2天后酶活性显著升高，说明低温诱导了SOD的重新合成，以避免活性氧等自由基的大量积累，从而增强机体的抗寒力。其中在低温处理第2天，晚熟品种K－1的SOD酶活性变化最为显著（P＜0．01），为对照的80．9%，早熟品种N52活性变化为对照的38．2%（P＜0．05）；低温处理第3天，晚熟品种K－1的SOD酶活性增加最大，为对照的162．4%（P＜0．01），其次是中熟品种N181，为157．9%，晚熟品种N203，为132．7%，中熟品种 N177，为116．4%，早熟品种 N52的SOD活性变化最小，为对照的92．8%。

图2 冷处理对棉花幼苗中超氧化物歧化酶（SOD）含量的影响Fig．2 The effect of low temperature on SOD activity

2．3 4℃处理对不同品种棉花幼苗丙二醛含量的影响

丙二醛（MDA）是常用的膜脂过氧化指标，MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。由图3可见，中熟品种N177和早熟品种N52的MDA含量在低温处理第1天有所降低，而中熟品种N181和晚熟品种N203基本不变；但是在处理第2天时，5个品种MDA含量都有不同程度的升高；其中中熟品种N181含量升高最为显著（P＜0．01），为对照的161．7%，其次变化较大的是中熟品种N177（P＜0．01），达到了对照的116．1%；晚熟品种N203在低温处理中，MDA含量一直升高，处理第3天时增加到了对照的52．8%；而低温处理过程中早熟品种N52的MDA含量变化较小，在处理第3天时略有升高，但MDA含量仍低于对照。MDA含量升高，说明膜脂受到损伤严重，含量越高说明膜损伤的程度越严重，不抗冻。早熟品种N52丙二醛含量变化最低，说明膜脂过氧化的产物较少，膜脂遭受的伤害较轻，即早熟品种N52抗冷性较强。

图3 冷处理对棉花幼苗中丙二醛（MDA）含量的影响Fig．3 The effect of low temperature on content of MDA

3 讨论与结论

温度是棉花整个生育期中所必需的环境因子，影响棉花生长发育的整个过程，是棉花产量形成的重要限制因子。在能够耐受的逆境范围内，通常情况下，低温处理会对棉花幼苗产生抑制效应。低温胁迫后，植物体内的氧代谢就会失调，可引起植物体内产生O－2、·OH、H2O2等活性氧自由基，而清除系统的功能降低，致使活性氧在体内积累，植物的膜结构与功能就会受到损伤，而适当的低温锻炼能提高植物细胞内保护酶系统［7］。由于超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）能清除活性氧自由基，在一定程度上保护着细胞膜系统，是膜保护酶系统中的主要成员，因而保护酶体系在逆境研究中颇受重视。SOD、POD的活性越高，保护生物膜的作用就越强，抗御冷损害的能力也就越强。在低温胁迫下，有关植物体内POD、SOD活性变化已有较多报道，但其变化规律则不一致，有研究表明苜蓿幼苗叶片POD、SOD活性变化趋势随低温胁迫时间的延长先上升，之后逐渐下降［8］。而冯建灿等［9］的研究表明喜树在低温条件下，SOD活性表现为先下降，后上升，然后再下降。本试验证明，棉花经4℃低温胁迫处理3d内，SOD活性逐渐升高，说明4℃低温诱导SOD的再合成，以避免活性氧等自由基的大量积累，从而增强机体的抗寒力。另外，由于早熟品种在低温胁迫下抗冷性强，植物体内本身产生的H2O2少，故早熟品种SOD活性变化较小。由此得出结论：用临界生长温度附近的低温锻炼棉苗，可以有效地提高SOD活性，降低低温胁迫中的冷害指数，进而提高其抗冷性。另外，分析了不同品种的抗冷性及同一品种在低温处理不同时间内SOD、POD活性的变化，有利于进行不同品种抗逆性的比较分析。本试验的研究对棉花抗冷品种的选育、种植棉区的扩大、棉花产量的提高，都有重要意义。

植物衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的最终分解产物，从膜上产生的位置释放后，与蛋白质、核酸起反应修饰其特征，抑制蛋白质的合成，MDA在植物体内的积累可能会对膜和细胞造成一定伤害，所以MDA的含量可以在一定程度上反应膜损伤的程度［10］。本试验研究结果表明，低温处理对不同棉花品种的生理指标有很大的影响，而且不同棉花品种对低温的敏感程度不同。低温处理明显改变了棉花幼苗SOD、POD活性及MDA含量。综合分析，4℃低温处理下，早熟品种N52的POD、SOD活性有所增加，MDA含量降低，即早熟品种N52抗冷性较强。

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［4］张志良．植物生理学实理指导［M］．北京高等教育出版社，2000：154－155．

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