猪圆环病毒2型感染的PCR检测

李 英

（山东省日照市五莲县畜牧兽医局，山东五莲 262300）

断奶仔猪多系统衰弱综合征（Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS）是近年来新发现的一种病毒性传染病。本病主要发生于4～14周龄的断奶仔猪，是一种能够感染多种组织器官的疾病，患猪主要表现为精神沉郁、渐进性消瘦、呼吸困难和显著的淋巴结肿大，偶尔有腹泻、胃溃疡和黄疸等症状。在急性暴发的情况下，发病率和死亡率会很严重，能达到4%～10%的发病率并有70%～80%的死亡率。感染猪容易继发其它病毒性或细菌性疾病，使病情加重。

PMWS的病原是猪圆环病毒（Porcine Circovirus，PCV），包括l型和2型两种类型（PCV1，PCV2），其中PCV2是PMWS的致病原。猪圆环病毒的基因组中开放阅读框l（ORF1）和开放阅读框2（ORF2）是PCVl和PCV2共有的主要阅读框，PCVl与PCV2的ORF2基因组同源性只有65%～67%。国内外通常采用ORF2设计特异性引物扩增PCV2基因片段，与PCVl不发生交叉反应。圆环病毒对外界环境的抵抗力较强，在酸性环境（pH3.0）及氯仿中可以存活较长时间，在72 ℃能存活15 min，56 ℃不能将其灭活。

近来在日照市某些规模化猪场发现类似PMWS的病例，本研究采集病猪肝、脾、肺、肾、淋巴结、血清等，用针对PCV开放阅读框2（ORF2）特异性的引物进行PCR检测，检测出阳性结果，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 发病情况

猪场中5～12周龄的猪表现生长受阻、消瘦，全身黄疸，渗出性皮炎等症状，病初，猪体温上升至40℃，后降至正常。发病初眼结膜发黄，后出血；病初猪便秘，后严重便血，并死亡。

剖检病变，全身贫血、黄疸，最显著的变化是全身淋巴结特别是腹股沟浅淋巴结、肠系膜淋巴结肿大，切面硬度增大。可见均匀的白色，有的出血，红白相间。脾肿大、梗死。肺间质性水肿，肺边缘及部分区域实变，肺尖叶和心叶肺泡出血，颜色加深。肾脏颜色变深，被膜下有坏死灶。心肌及心冠状脂肪出血，心肌有白色梗死区。肝脏黄疸，肝小叶间结缔组织增生，切面有颗粒感。肠出血性卡他性炎症，肠黏膜脱落。胃壁黏膜脱落，出血性溃疡。

1.2 病料采取

本实验采集猪场中10头表现PMWS症状的断奶仔猪，取其肝、脾、肺、肾、淋巴结、血清等病料，按l:5加pH7.2的Hank'S液，于灭菌组织研磨器中充分研磨成乳状物，-20 ℃反复冻融3次，5000 r/min离心5 min，取上清液，-20 ℃保存备用。

1.3 病料的细菌检测

取心血、肝、肺、脾、胆囊等病料分别接种于血液琼脂平板、普通琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板，进行细菌分离。

1.4 PCR检测

1.4.1 试剂与材料

琼脂糖、Taq酶、dNTP、DL2000 Marker等，试剂均购自大连宝生物工程公司。标准PCV2毒株由日照市动物疫病预防控制中心保存。

1.4.2 引物参考 Genbank中注册的PCV2序列设计了针对PCV2开放阅读框2（0RF2）的特异性引物：

上游引物：5'-acctatcatccatcagaaacc-3'；

下游引物：3'-ttaggactgagaggagttgtt-5'

p1和下游引物p 2的扩增片段长952 bp。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成，用灭菌击离子水配成50 Pmol/uL溶液，-20 ℃保存备用。

1.4.3 病料总DNA的提取

取300 ul上述病料上清液，加等体积的裂解液（20 mmol/uL Tris-CI PH8.0；0.5%SDS ），5 uL 蛋白酶K（20 mmol/uL），50 ℃消化 2 h。12000 r/min离心15 min取上清液．然后分别用等体积的饱和酚/氯仿/异戊醇（V/V/V=25/24/1）提取组织中的总DNA，最后用乙醇沉淀DNA ，并将沉淀的DNA溶解在无DNA酶的TE（pH7.5）缓冲液中，-20 ℃保存备用。

1.4.4 PCR扩增

将上述抽提得到的总DNA作为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为50 uL，包括10×PCR缓冲液5 uL，dNTP（2.5 mmol/uL）4 uL，Mgcl2（25 mmol/uL）35 uL，引物P1，P2各1 uL，模板1 uL，Taq酶（ 5 u/uL ）0.5 uL，ddH2O34 uL。

反应条件为95 ℃预变性5 min，为1个循环；之后以 94 ℃ l min，50 ℃ l min，72 ℃ 1.5 min。共进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min。取5 uLPCR产物在0.8%琼脂糖上电泳，于紫外灯下观察，拍照并记录实验结果。

2 结果

2.1 PCR检测结果

分别在脾、淋巴结和血清等病料中扩增出大约952 bp的片段。与PCV2阳性对照扩增的片段大小一致。阴性对照中没有扩增出任何条带。所得结果如图1。

2.2 细菌检测结果 病料接种的血琼脂平板、普通营养琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板均无细菌生长。

3 讨论

3.1 现已证实圆环病毒会导致断奶仔猪多系统衰弱综合征（PMWS）的主要病原猪是圆环病毒的天然宿主，病毒通过胎盘垂直传播。或在猪群中水平传播，各种年龄、不同性别的猪都可感染生长猪发病率高。多呈隐性感染，但4～16周龄的断奶仔猪感染会导致严重的PMWS等疾病。由于PMWS是一种免疫抑制性疾病。而且还怀疑PCV2与猪皮炎和肾脏综合征、间质性肺炎和繁殖障碍等疾病有关，往往会给养猪业造成严重的威胁和损失。

3.2 本研究中发病猪呈现的特征性临床症状及病理变化与 PCV2感染引起的PMWS一致。利用PCR检测方法可以快速简便、准确地对PCV2病原进行检测。本研究为圆环病毒的快速准确诊断提供了科学依据。

[1]谢俊良，杨增岐，赵华，等.猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及应用[J].中国动物检疫，2006，23（11）：33-34.

[2]刘守媛.猪圆环病毒2型分子生物学及诊断方法研究进展[J].中国动物检疫，2006，23（9）：45-47.