痛泻要方对内脏高敏感大鼠结肠黏膜蛋白质表达谱的影响

丁 莺 吕 宾 孟立娜 范一宏 沈 雁

杭州市下沙医院急诊科1(310018) 浙江中医药大学附属第一医院消化内科2

肠易激综合征(IBS)是一种常见的胃肠功能紊乱性疾病，西方国家人群的患病率高达10% ～20%［1］;我国城市居民患病率为 10.50%，乡村为6.14%［2］。一项韩国研究［3］显示IBS相关症状可对患者的健康相关生活质量(HRQOL)产生重大影响，对社会造成沉重的经济负担。IBS的发病机制目前尚未完全阐明，可能与肠道动力、分泌、感觉等异常相关［4］。蛋白质组学能从组织脏器整体水平上动态定量地观察疾病过程中蛋白质的改变，有助于探寻疾病的发病机制。本研究运用蛋白质组学技术观察痛泻要方对内脏高敏感大鼠结肠黏膜蛋白质表达谱的影响，旨在从分子水平探讨痛泻要方对IBS起效的可能作用机制。

材料与方法

一、主要材料

1.实验动物:清洁级成年雌性Sprague－Dawley(SD)大鼠24只，体质量约200 g，由浙江中医药大学实验动物中心提供，合格证号:SYXK(浙)2008－003。于室温22～24℃、湿度 ＜60%、噪音 ＜50 dB的环境中分笼饲养，正常饮水摄食。

2.痛泻要方煎剂制备:按成人体质量60 kg，痛泻要方包括炒白术15 g、炒白芍12 g、防风10 g、陈皮6 g。大鼠用药量以成人单位体质量的6.25倍计算。取生药颗粒剂，以蒸馏水作为溶剂，充分搅拌使其溶解，配置生药浓度1 g/mL，40℃避光保存，置于避光饮水瓶中。按生药4.5 g·kg－1·d－1，即痛泻要方煎剂4.5 mL·kg－1·d－1给药，由浙江中医药大学附属第一医院制剂室提供。

3.主要试剂:考马斯亮蓝 R－250、二硫苏糖醇(DTT)、尿素、琼脂糖、甘油、溴酚蓝、3－(3－胆酰胺丙基)二甲氨基－1－丙磺酸(CHAPC)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、碘乙酰胺(IAA)、固相pH梯度(IPG)胶条(pH 3～10)和Bradford蛋白定量试剂盒购自美国Bio－Rad公司;硫脲购自美国Fluka公司;通用蛋白酶抑制剂混合物(PIC)购自瑞士Roche公司;CyDye荧光染料试剂盒购自美国GE Healthcare公司;赖氨酸购自美国Amresco公司;Milli－Q水购自于美国Millipore公司;兔抗鼠/人二硫键异构酶结合蛋白(PDIA3)多克隆抗体购自英国Abcam公司;羊抗兔多克隆抗体和化学发光试剂购自北京康为世纪生物科技有限公司。细胞裂解液自行配制，内含Tris 30 mmol/L、硫脲 2 mol/L、4%CHAPC，以 HCl调整pH值为8.5。重泡涨液自行配制，内含尿素7 mol/L、硫脲 2 mol/L、4%CHAPS、1%IPG 缓冲液、DTT 40 mmol/L、痕量溴酚蓝。胶条平衡液自行配制，内含尿素180 g、十二烷基硫酸钠(SDS)10 g、TrisCl(pH 8.8)16.75 mL、甘油 150 mL，以 Milli－Q水定容至500 mL。

4.主要仪器:Ettan IPGphorⅡ型等电聚焦仪和Ettan DALTsix大规模垂直电泳系统购自美国GE Healthcare公司;Typhoon 9410多功能激光扫描成像系统、全自动斑点切取系统Ettan Spot Picker和自动质谱点样系统 Ettan Spotter购自美国 Amersham Biosciences公司;基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(4800 Plus MALDI TOF/TOF质谱仪)购自美国ABI公司;400R型台式低温高速离心机购自德国Heraeus公司。

二、方法

1.动物分组和造模方法:24只大鼠顺序编号，按随机数字表法分为3组:空白对照组、模型对照组和治疗组，每组各8只。空白对照组大鼠在正常条件下饲养，后两组参照晁冠群等［5］的方法，以樟脑丸特殊气味作为条件刺激，结直肠扩张结合经典的肢体束缚作为非条件刺激，建立内脏高敏感模型。将大鼠装入放有樟脑丸的应激笼，用胶布固定四肢和躯干45 min，限制自由运动，但可作少许前后活动和回头。固定后将气囊导管经肛门插入直肠，气囊远端距肛门口约1 cm，并固定于鼠尾。气囊内压力＞60 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，以间断充气法行结直肠扩张，每次充气1.6 mL，持续60 s，以3 min的间隔重复充气10次，完成1次应激程序。第1 d完成1次应激程序后放回原饲养环境，第2 d同一时间给予同样应激程序1次，第4 d给予条件刺激45 min，第5 d重复应激程序，第6、8 d给予条件刺激45 min，第3、7 d正常喂养。模型制备成功后，各组给予不同的药物干预。空白对照组和模型对照组大鼠均以 0.9%NaCl溶液 4.5 mL·kg－1·d－1灌胃，治疗组以痛泻要方煎剂 4.5 mL·kg－1·d－1灌胃，连续4周。

2.模型验证方法:实验第14 d，将石蜡油润滑后的8F导尿管经肛门插入，将球囊末端置于距离肛门1.0 cm处，用棉线将导尿管固定于大鼠尾巴根部。待大鼠适应环境后，逐渐注水使球囊扩张，行大鼠腹壁回撤反射(AWR)评分。AWR评分标准:0分，大鼠对结直肠扩张无行为学反应;1分，结直肠扩张时身体静止不动，头部运动减少;2分，结直肠扩张时腹肌收缩，但腹部未抬离桌面;3分，结直肠扩张时腹肌收缩并抬离桌面;4分，结直肠扩张时骨盆抬起，身体呈弓形。记录AWR评分为3分时所需的注水量。每次结直肠扩张持续30 s，重复进行3次，取均值。

3.干预后内脏敏感性评估:实验第43 d，对各组动物行直肠注水扩张实验，采用AWR评分评估大鼠内脏敏感性，具体操作方法同前。

4.大鼠结肠黏膜组织蛋白质样品的制备:实验第45 d，大鼠腹腔注射10%水合氯醛深麻醉处死，取距回盲部约2 cm的结肠1块，按100 mg样品加300 μL组织裂解液的比例加入裂解液，同时加入1%核酸酶和1%PIC，混匀、匀浆，研磨时避免产生泡沫。然后室温变性作用60 min。4℃ 20 627×g离心30 min，收集上清液，应用Bradford法测定每份蛋白质样品浓度，分装后－80℃冻存备用。

5.蛋白质样品的荧光标记:将空白对照组、模型对照组和治疗组样品pH值调至8.5。避光条件下50 μg空白对照组样品(5 ～ 10 μL)加入 1 μL(400 pmol)CyDye Cy3，50 μg 模型对照组样品加入1 μL(400 pmol)CyDye Cy5，再各取两组样品 25 μg加入1 μL(400 pmol)CyDye Cy2(作为内标1)。另取两组样品进行反标，即空白对照组样品中加入CyDye Cy5、模型对照组样品中加入CyDye Cy3，样品和荧光染料用量以及内标1设置同上。

避光条件下50 μg模型对照组样品(5～10 μL)加入 1 μL(400 pmol)CyDye Cy3，50 μg 治疗组样品加入1 μL(400 pmol)CyDye Cy5，再各取两组样品25 μg 加入 1 μL(400 pmol)CyDye Cy2(作为内标2)。另取两组样品进行反标，即模型对照组样品中加入CyDye Cy5、治疗组样品中加入CyDye Cy3，样品和荧光染料用量以及内标2设置同上。

避光冰浴30 min后，加入10 mmol/L赖氨酸1 μL终止反应。

6.差异蛋白质筛选:采用荧光差异双向凝胶电泳法(2D DIGE)。将3种荧光染料标记的蛋白混合，重泡涨液定容至450 μL。20℃条件下采用Ettan IPGphorⅡ等电聚焦仪将24 cm IPG胶条水化重泡涨6 h，以设定程序进行第一向固相pH梯度等电聚焦(IEF)，总电压时间为80 000 V·h。然后将胶条分别放置在含2%DTT和4%IAA胶的平衡液中各振荡平衡15 min，再移至12.5%的SDS－聚丙稀酰胺凝胶电泳(PAGE)均一胶上，行第二向SDSPAGE电泳。置于Ettan DALTsix大规模垂直电泳仪中20℃、40 mA恒电流电泳，直至溴酚蓝到达胶的底端。Typhoon 9410多功能激光扫描成像系统扫描双向电泳凝胶，Cy2的激发光和发射光波长分别为480、530 nm，Cy3分别为540、590 nm，Cy5 分别为620、680 nm。扫描后采用DeCyder 5.0软件(美国Amersham Bioscience公司)分析图像文件，挑选出空白对照组与模型对照组、模型对照组与和治疗组之间蛋白表达量比值绝对值≥1.4的差异蛋白点。

7.差异蛋白质鉴定:采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI－TOF MS)。取空白对照组和模型对照组蛋白样品各500 μg以及模型对照组和治疗组样品各500 μg，按常规方法行双向电泳后，考马斯亮蓝染色，采用Ettan Spot Picker全自动斑点切取系统机械手臂挖取与明显差异表达蛋白点相匹配的蛋白点。50%乙腈冲洗、胰蛋白酶消化、自动质谱点样系统Ettan Spotter行蛋白样品点样后，应用4800 Plus MALDI TOF/TOF质谱仪进行检测，获取含有序列信息的二级质谱图，应用MASCOT软件在国际蛋白质索引(international protein index，IPI)数据库中进行蛋白质匹配，获取应用MALDITOF－MS/MS技术鉴定差异蛋白质的得分。当某个蛋白质的得分＞60时，可以认为鉴定成功。应用Gene Ontology软件对这些差异蛋白质进行功能和亚细胞定位分类。

三、统计学分析

结 果

一、模型验证

AWR评分为3分时，造模大鼠(包括模型对照组和治疗组大鼠)和空白对照组所需的注水量分别为(0.90±0.12)mL和(1.49±0.18)mL，造模大鼠的内脏敏感性明显高于空白对照组(P＜0.01)，表明造模成功。

二、痛泻要方对大鼠内脏敏感性的影响

AWR评分为3分时，模型对照组大鼠所需的直肠注水量明显低于空白对照组［(0.90±0.16)mL对(1.63±0.17)mL］，差异有统计学意义(P＜0.01)，提示模型对照组大鼠内脏敏感性明显增高。给予痛泻要方治疗后，治疗组注水量明显高于模型对照组［(1.23±0.10)mL对(0.90±0.16)mL］，差异有统计学意义(P＜0.01)，提示治疗组内脏敏感性较模型对照组明显降低。

三、差异蛋白质筛选

经DeCyder 6.5软件分析，治疗组和模型对照组大鼠结肠黏膜组织样品中共有1278个蛋白匹配点，其中差异表达蛋白点61个，23个蛋白点在治疗组的表达明显上调，38个蛋白点在治疗组明显下调(见图1)。

四、差异蛋白质鉴定

从61个差异蛋白点中人工筛选出5个差异表达明显的蛋白点进行质谱分析。经IPI数据库检索，鉴定出3个特异蛋白质(见表1)，治疗组大鼠结肠黏膜组织中表达上调的蛋白质为Transgelin(TAGLN)蛋白和乙醛脱氢酶2(Aldh2)，表达下调的蛋白质为角蛋白8(CK8)。

图1 治疗组和模型对照组大鼠结肠黏膜组织蛋白样品的荧光差异双向凝胶电泳图

表1 治疗组和模型对照组大鼠结肠黏膜组织间差异蛋白质鉴定结果

讨 论

痛泻要方源自《景岳全书》，具有补脾柔肝、祛湿止泻之功效，长期临床观察证实其对腹痛、腹泻疗效显著。IBS发病的病理基础为肝郁脾虚，病机主要在于肝脾气机不畅，运化失常，大肠传导失司，日久及肾，形成肝、脾、肾、肠胃诸脏功能失调。忧思恼怒，久郁不解，伤及于肝，肝气不疏，横逆及脾，脾气失和，可形成肝脾不调证。痛泻要方所治痛泻，是由脾虚肝旺、肝气乘脾、升降失常而致，所谓“土虚木贼”之证，即肝郁脾虚证。痛泻要方由白术、陈皮、白芍、防风中药组成，其中白术燥湿健脾，白芍养血泻肝，陈皮理气醒脾，防风散肝舒脾。诸药合用，可补脾土而泻肝木，调气机以止痛泻。结合痛泻要方对IBS有疏肝健脾、益气和胃的功效［6］。

本研究以痛泻要方治疗4周后，治疗组大鼠内脏敏感性明显降低(P＜0.01)，说明补脾柔肝法对调节内脏高敏感具有一定的作用。以药测证，由此推测大鼠内脏敏感性的形成机制主要为肝郁脾虚。任何形式的应激首先影响机体正常气机，肝主疏泄可调节全身气机，因此肝脏可能是机体调节应激的核心，肝主疏泄功能对机体应激具有重要的调节作用［7］。IBS腹痛、腹部不适与内脏高敏感高度相关，而IBS腹痛、腹部不适反复发作多与心理因素有关，如着急或生气时易发作，说明气机郁滞可能是内脏敏感性增高的主要原因之一，运用痛泻要方能明显调节内脏高敏感大鼠的内脏敏感性。

TAGLN是具有转型变异和形状改变敏感性的肌动蛋白凝胶蛋白，由 Lees－Miller等［8］在鸡平滑肌中首先发现。TAGLN蛋白在平滑肌中表达较高，可能与细胞分化和细胞骨架重排有关。程云会等［9］的研究结果表明，TAGLN基因参与血管平滑肌细胞的细胞骨架构成以及调节细胞收缩功能，对维持血管平滑肌细胞处于收缩表型具有重要作用。Aldh2催化乙醛脱氢生成乙酸，后者进入三羧酸循环，代谢为CO2和H2O，是乙醇代谢的关键酶之一。本研究发现给予痛泻要方治疗后，TAGLN蛋白和Aldh2表达均较模型对照组明显上调，但其与内脏敏感性的相关性有待进一步研究。

上皮细胞内含有20种CK，CK8在维持胃肠道上皮结构和功能方面起重要作用。CK8缺失小鼠可发生慢性结肠炎［10］和水电解质转运紊乱［11］，为细菌移位致病创造条件。CK8突变可引起人肠道上皮细胞抵抗力降低，可能在炎症性肠病的发生中扮演重要角色［12］。有文献报道IBS患者存在肠道部分菌群失调以及黏膜低度炎症［13］。CK8表达增加可能在肠道黏膜上皮抗促炎刺激物中发挥作用。本课题组的前期研究［14］显示内脏高敏感大鼠结肠黏膜组织中CK8表达增加，提示结肠黏膜存在低度炎症反应，可能引起内脏敏感性增高。本研究给予痛泻要方治疗后，大鼠结肠黏膜CK8蛋白表达较模型对照组下调，内脏敏感性亦明显降低，提示痛泻要方可下调炎症相关蛋白的表达，这可能是其降低大鼠内脏敏感性的机制之一。但IBS的发生机制复杂，包括肠道免疫、炎症、神经内分泌网络调控变化等。针对目前已鉴定出来的2个上调蛋白和1个下调蛋白在IBS发生和治疗中的作用，尚需进一步研究加以证实。

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