阿魏酸川芎嗪抗血栓形成作用及其对血小板中性粒细胞黏附的影响

赵润英，郝伟，孟祥军，赵丽妮，李昭，魏巍

（沈阳医学院1.药理教研室；2.机能实验中心；3.药物化学教研室；4.沈阳博润生物技术有限公司，沈阳 110034）

近年来，血小板白细胞聚集体（platelet-leukocyte aggregates，PLA）作为一种影响血栓形成的重要因素，正逐渐引起国内外心脑血管病专家的重视［1］。研究PLA的发生机制和寻找PLA形成的抑制药物，对缺血性心脑血管疾病的预防与治疗具有深远的意义。阿魏酸川芎嗪（ligustrazine ferulic，LF）是以活血化瘀中药川芎的有效成分——LF结构为基础合成的阿魏酸盐类化合物，已被证实其具有抗ADP诱导的血小板聚集作用［2］，且作用强于川芎嗪。本实验初步评价LF抗血栓形成作用，并通过LF对血小板P-选择素表达和对血小板与中性粒细胞黏附的影响，进一步探讨其抗血栓形成的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：健康雄性SD大鼠50只，体质量250～300 g，沈阳医学院实验动物中心提供。

1.1.2 仪器：SEN-7203型三道电子刺激器（日本NihonKodehn公司）；DVM-4200型超声血液流量计（日本Hayashi Denki公司）；LBY-NJ4型血小板聚集仪（北京普利生公司）；FACSCalibur流式细胞仪（美国Becton-Dickinson公司）。

1.1.3 药品与试剂：LF（沈阳医学院药研中心）：临用前用TMP助溶剂和注射用水溶解后制成4%、8%、16%的溶液；硫酸氢氯吡格雷（clopidogrel sul－fate，CS，湖北海柏元化工有限公司）：临用前用注射用水溶解后制成1.3%的溶液；TMP助溶剂（济南慧萌生物科技公司）；凝血酶（thrombin，美国Sigma公司）；异硫氰酸荧光素标记的血小板P-选择素单克隆抗体（CD62P-FITC，美国Coulter公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及给药：50只雄性SD大鼠随机分成生理盐水对照组（NS组）、硫酸氢氯吡格雷8 mg·kg-1阳性对照组（CS组）、阿魏酸川芎嗪 4 mg·kg-1低剂量组（LF1组），阿魏酸川芎嗪8 mg·kg-1高剂量组（LF2组），阿魏酸川芎嗪4 mg·kg-1+硫酸氢氯吡格雷4 mg·kg-1组（LF+CS组），每组10只。

1.2.2 动脉血栓形成实验：参照魏伟主编《药理实验方法学》的方法［3］。

1.2.2.1 电刺激颈动脉血栓形成 利用电刺激，破坏局部血管，使血管内皮损伤，促使血小板黏附聚集从而形成血栓。大鼠用20%乌拉坦50 mg·kg-1腹腔注射麻醉后，分离左颈总动脉和左股静脉。左股静脉置管按1 mL·kg-1体质量注射给药，给药后15 min，左颈总动脉置2根银制电极，超声探针置近头端，用电刺激器以1.5 mA的直流连续刺激大鼠颈动脉7 min，用超声血流量仪记录血栓形成时间（即从刺激开始至颈动脉血流量为“零”的时间，thrombosis time，TT）。观察刺激开始后60 min内的血流量变化，如血管仍未栓塞，则以60 min作为最大TT。

1.2.2.2 动静脉旁路血栓形成 大鼠用20%乌拉坦50 mg·kg-1腹腔注射麻醉后，分离右颈总动脉和左颈外静脉。在聚乙烯管的中段放入一根长6 cm的丝线，以肝素-生理盐水溶液（50 U·kg-1）充满聚乙烯管，当聚乙烯管的一端插入左颈外静脉后由聚乙烯管准确的注入肝素（50 U·kg-1）抗凝，然后再将聚乙烯管的另一端插入右颈总动脉。打开动脉夹，血液从右颈总动脉流至聚乙烯管，返回左颈外静脉。先于颈外静脉按1 mL·kg-1体质量注射对照药和受试药，2 min内注完。20 min后制作血栓模型，并开放血流15 min后，中断血流，迅速取出丝线称重，总质量减去丝线质量即得血栓湿重（waterish thrombus weight，WTW）。计算各药的血栓形成抑制率（thrombosis inhibition ratio，TIR）。

TIR=［（空白组血栓质量-给药组血栓质量/空白组血栓质量）］×100%。

1.2.3 血小板中性粒细胞黏附实验

1.2.3.1 标本采集 颈动脉取血，收集于一次性含肝素抗凝剂塑料离心管中。取血量与抗凝剂的比例为9∶1，立即颠倒充分混匀。

1.2.3.2 洗涤血小板的制备［4］抗凝血标本用水平离心机600 r/min离心5 min，小心吸取上层富含血小板血浆（platelet-richplasma，PRP）。PRP以1000r/min离心10 min获得浓缩血小板，用0.9%的生理盐水对浓缩血小板进行3次洗涤，并悬浮于0.9%的生理盐水中，计数其血小板数量，并调整血小板密度为200×109/L；取细胞液涂片，用台盼蓝拒染试验和Giemsa染色，鉴定其存活率>95%。

1.2.3.3 中性粒细胞（po1ymorphoneuc1ear 1eucocyte，PMN）的制备 在上述吸出PRP后的抗凝血中，加入与PRP等体积的生理盐水和1/6体积的6%右旋糖酐（Dextran T 500）混匀。37℃静置30 min，沉淀红细胞。将上层白细胞吸出轻浮于3 mL淋巴细胞分离液中，500 r/min离心30 min；取出底部中性粒细胞，加入1 mL双蒸水溶血30 s，使红细胞破膜，再加2倍浓度的PBS 1 mL，然后离心10 min，中性粒细胞团块用PBS洗3次，最后悬浮于2～3 mL 0.1%白明胶Hank’s液中 （溶媒组胞外含l mmoL/L CaCl2或5 mmol/L EGTA分别反应有钙或无钙的情况）。调整细胞密度为200×109/L；取细胞液涂片，用台盼蓝拒染试验和Giemsa染色，鉴定其存活率>95%。

1.2.3.4 玫瑰花结试验 采用改良Hamburger方法［5］，取 50 μL 血小板与凝血酶（0.2 U/mL）37 ℃ 温育15 min，然后分别加溶媒（menstruum）或不同浓度的药物各50 μL，继续静置15 min，再加入中性粒细胞悬液100 μL，于4℃振荡30 min。取出少许细胞悬液，在常规计数板上于40倍镜下随机计数100个中性粒细胞，其周围黏附有2个或2个以上血小板者为玫瑰花结试验阳性。每样本计数3次，取其均值，计算玫瑰花结形成百分率（黏附率，adherence rate，AR）和黏附抑制率（adherence inhibition ratio，AIR），并求出 IC50。

AIR=［（溶媒管黏附率-给药管黏附率）/溶媒管黏附率］×100%

1.2.4 血小板P-选择素的测定：采用流式细胞技术法测定血小板P-选择素表达的阳性率。大鼠静脉血以5%枸橼酸钠抗凝（抗凝剂∶血=1∶9），以800r/min离心 5～10 min，取富含血小板的血浆（PRP），制成血小板悬液，取100 μL血小板悬液分别加入试管，并加入CD62P-FITC，不加CD62P-FITC的试管为阴性对照，室温避光反应30 min，1 500 r/min离心5 min，弃上清，磷酸盐缓冲液漂洗2次后上机检测，收集10 000个血小板，血小板P-选择素表达阳性率由带荧光的异硫氰酸盐标记的血小板百分数确定。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 LF对电刺激大鼠颈动脉法血栓形成的影响

与CS阳性对照组比较，血栓形成时间CS+LF组较长，LF1组较短（P＜0.01），均有显著性差异；而LF2组血栓形成时间略短，但差异无统计学意义（P＞0.05）。NS空白对照组的血栓形成时间明显短于CS阳性对照组，有显著性差异（P＜0.01）。见表1。

表1 LF对电刺激大鼠颈动脉法和动静脉旁路法血栓形成的影响（±s，n=10）Tab.1 Effects of ligustrazine ferulate on electrically stimulated carotid thrombosis and bypass thrombosis between carotid and jugular vein in rats（±s，n=10）

表1 LF对电刺激大鼠颈动脉法和动静脉旁路法血栓形成的影响（±s，n=10）Tab.1 Effects of ligustrazine ferulate on electrically stimulated carotid thrombosis and bypass thrombosis between carotid and jugular vein in rats（±s，n=10）

Compared with NS group：1）P ＜ 0.01；compared with CS group：2）P ＜ 0.05.

Group Dose（mg·kg-1） WTW（mg） TIR（%） TT（min）NS - 20.43±6.681） - 18.1±2.41）CS 8 12.16±5.94 40.5 32.9±3.6 LF1 4 17.71±8.321） 13.3 27.1±2.01）LF2 8 13.55±5.13 33.7 30.8±5.1 LF+CS 4+4 10.12±4.261） 49.5 36.5±3.91）

2.2 LF对大鼠动静脉旁路法血栓形成的影响

与CS阳性对照组比较，CS+LF组血栓湿质量较轻，血栓抑制率较高，LF1组血栓湿质量较大，血栓抑制率较低，有显著性差异（P＜0.01）；而LF2组血栓湿质量略重，但差异无统计学意义（P＞0.05）。NS空白对照组血栓湿质量明显高于CS阳性对照组，有显著性差异（P＜0.01）。见表1。

2.3 LF对大鼠血小板P-选择素的影响

血小板P-选择素在NS空白对照组和LF1组的表达较多，在CS+LF组的表达较少（P＜0.01），与CS阳性对照组比较，有显著性差异。LF高剂量组的血小板P-选择素的表达略高于CS阳性对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

2.4 LF对大鼠血小板与中性粒细胞黏附的影响

胞外存在1 mmol·L-1的CaCl2时，溶媒组用凝血酶激活的血小板与中性粒细胞之间形成的玫瑰花结为（71.2±5.9）%。与溶媒组比较，不同浓度的LF、CS和LF+CS组的黏附率均显著降低，黏附抑制率显著提高，有显著性差异（P＜0.01）；对应浓度的LF组指标低于CS组，有显著性差异（P＜0.05）；对应浓度的LF+CS组指标高于CS和LF组（P＜0.01）。见表 2。LF，CS 和 CS+LF 的 IC50分别为 64.3 μmol·L-1、62.5 μmol·L-1和 59.8 μmol·L-1。

3 讨论

不稳定心绞痛、急性心肌梗死、缺血性脑卒中等急性心脑血管疾病具有极高的致死率或致残率，其主要病理基础是动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）。近年来研究表明，PLA在动脉粥样硬化性血栓形成性疾病的发生和发展中起着重要作用［5］。PLA是血小板活化的敏感指标［6］，血小板活化后，血小板膜表面的 P-选择素（P selectin）和糖蛋白Ⅱb/Ⅲa（GPⅡb/Ⅲa）的表达增加，血小板通过P-选择素与白细胞膜表面的P-选择素配体糖蛋白1（P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1）的结合而与白细胞黏附形成PLA。此外，血小板表面的GPⅡb/Ⅲa和白细胞表面的黏附受体Mac-1（CD11b/CD18）分别与纤维蛋白原结合，通过纤维蛋白原的桥接作用形成PLA［7］。但P-选择素与PSGL-l相互作用是PLA形成的主要途径［8］。P-选择素即CD62p，是一种分子质量约为140 kDa的跨膜糖蛋白，通常储存于血小板的α颗粒和内皮细胞的Weibel-Palade小体中。PSGL-l也是一种跨膜糖蛋白，主要表达在白细胞的微绒毛体上，是惟一与P-选择素具有高度亲和力的配体。研究发现，当血小板或内皮细胞受凝血酶、组胺、肿瘤坏死因子等刺激而活化后，α颗粒和Weibel-Palade小体膜、胞膜迅速融合，使储存的P-选择素在细胞表面快速表达并与PSGL-1结合，从而介导活化的内皮细胞和血小板与中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等相互作用，且这种作用是通过钙离子的参与来调节的［9，10］。目前认为 PLA 的作用主要有：（1）促进白细胞在血管损伤处聚集以及参与随后的血管内膜增生；（2）参与动脉粥样硬化不稳定性；（3）增加组织因子介导的凝血酶产生；（4）在缺血/再灌注过程中形成小血栓阻塞微血管；（5）促进各种细胞因子、血管活性物质的释放；（6）影响血小板和白细胞的功能等。PLA作为血小板活化的敏感指标，在临床上已经成为急性冠脉综合征和冠脉介入手术抗血小板治疗中的新兴研究靶点［11］，阻断P-选择素有望成为稳定动脉粥样硬化斑块及防治急性心脑血管疾病的有效治疗手段。本研究发现，LF能够明显降低由凝血酶激活的血小板与中性粒细胞的黏附率、明显延长电刺激颈动脉法的血栓形成时间和减轻动静脉旁路法的血栓湿质量，提示其具有较强的抗血栓形成作用；其机制可能与LF抑制血小板的活化，降低大鼠血小板P-选择素的表达，从而减少血小板通过P-选择素与白细胞表面的PSGL-1结合，减少PLA的形成有关。但LF是否能够阻断P-选择素与PSGL-1的结合，从而抑制PLA的形成尚有待进一步的研究。

表2 LF对凝血酶激活的大鼠血小板与中性粒细胞间黏附的影响（±s，n=10）Tab.2 Effect of ligustrazine ferulate on platelet-neutrophil adhesion by means of thrombin activation in rats（±s，n=10）

表2 LF对凝血酶激活的大鼠血小板与中性粒细胞间黏附的影响（±s，n=10）Tab.2 Effect of ligustrazine ferulate on platelet-neutrophil adhesion by means of thrombin activation in rats（±s，n=10）

Adherence rate of menstruumgroup：（71.2±5.9）%；1）compared with menstruumgroup，P ＜ 0.01；2）compared with LF group，P ＜ 0.05；3）compared with CS group，P ＜ 0.05.

Drug LF CS LF+CS concentration AR AIR AR AIR AR AIR（μmol/L） （%） （%） （%） （%） （%） （%）0.00 69.5±4.9 2.4 68.8±8.1 3.4 69.1±5.9 2.9 18.75 45.2±5.11） 36.5 40.2±2.91），2） 43.5 37.4±3.11），2），3） 47.5 37.50 37.8±4.61） 46.9 32.5±4.11），2） 54.4 28.6±4.51），2），3） 59.8 75.00 30.4±4.71） 57.3 26.1±2.41），2） 63.3 23.8±2.81），2），3） 66.6 150.00 24.6±5.51） 65.4 20.4±5.21），2） 71.3 18.2±3.51），2），3） 74.4 300.00 19.3±3.21） 72.9 17.1±3.11），2） 76.0 15.2±2.21），2），3） 78.7

硫酸氢氯吡格雷作为ADP受体拮抗剂，对PLA的形成有明显的抑制作用［12，13］，临床主要用于心肌梗死、缺血性脑卒中和急性冠脉综合征的治疗。本研究表明低剂量LF的抗血栓作用弱于硫酸氢氯吡格雷，高剂量LF的抗血栓作用与硫酸氢氯吡格雷相当，而二者剂量减半后合用则具有明显的协同作用效果。因此，本试验为LF应用于治疗急性心脑血管疾病提供了一定的科学依据。

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