缺血后处理对大鼠脑缺血再灌注的神经保护作用

韩冬，孙淼，张硕，张鸿，冯娟

（中国医科大学附属盛京医院神经内科，沈阳 110004）

缺血性脑卒中是临床常见病和多发病，目前临床已开展溶栓治疗和动脉介入治疗使闭塞的脑动脉再通，但血管再通后再灌注会加重组织细胞功能代谢障碍及结构破坏，即再灌注损伤［1］。如何寻找有效的方法减轻再灌注损伤是临床上治疗脑梗死的关键。最近研究发现，缺血后处理能够能减轻缺血再灌注损伤，是一种有效的内源性保护机制，已成为脑保护研究的热点。脑缺血后处理［2］是指在缺血再灌注后一定时间内，给予1次或多次短暂性缺血再灌注，使脑组织对前面较长时间的缺血产生耐受性。本实验采用大脑中动脉线拴法复制大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，研究缺血后处理对大鼠脑缺血再灌注后的脑保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

雄性清洁级Wistar大鼠，体质量250～280 g，由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供。动物随机分为假手术组、缺血再灌注组（I/R组）和缺血后处理组（IP组），每组10只。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型：采用Longa法［3］制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。实验组大鼠术前12 h禁食，不禁水。术前称重，按0.3 mL/100 g体质量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠后，取正中右旁开0.5 cm作纵行切口。在显微镜下分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉。结扎颈外动脉，暂时夹闭颈总动脉、颈内动脉阻断血流，用眼科剪在颈外动脉残端血管壁上剪一小口，将准备好的栓线（头端直径0.28 mm，购自北京沙东生物技术有限公司）插入颈外动脉，继续进入颈内动脉，当遇到轻微阻力时停止，结扎栓线根部丝线。栓线插入深度为18～20 mm，其头端恰好位于大脑中动脉起始处，阻断了该动脉的血流。将多余的栓线剪去，将其尾端置于正中切口皮下，缝合切口。假手术组栓线插入深度为10 mm，使栓线头端停留于颈内动脉内而不进入大脑中动脉内。缺血120 min再灌注时，将大鼠再次麻醉，剪开切口缝合线，在手术显微镜下部分抽出栓线，将栓线抽出5 mm，此时大脑中动脉血流再通。术中用电热毯及电烤灯保持大鼠肛温在36～37℃，术后分笼饲养，24 h后取材。

1.2.2 缺血后处理：在缺血120 min再灌注开始前拔出5 mm栓线，使血管再通30 s，然后再将栓线插入5 mm，阻断血流30 s，如此进行3个循环，进行缺血后处理。之后拔出栓线实现永久再灌注。

1.3 神经功能缺失评分

参照文献［3］的5分制评分标准：0分，无神经损伤症状；1分，对侧前爪不能完全伸直；2分，行走时向对侧转圈；3分，站立不稳，向对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。术后约1 h动物可苏醒，观察神经功能缺失情况。累计1分以上即为成功模型。

1.4 脑梗体死积测定

TTC染色：脑切成2 mm厚，放于2%TTC染液中，37℃温育15 min。正常脑细胞染成橘红色，梗死区不着色，用图像处理软件Photoshop 5.0计算梗死面积（橘红色区域为正常脑组织，白色区域为梗死区）、各脑片梗死面积之和乘以厚度（2 mm）为总的梗死容积。梗死体积百分率=（正常侧大脑半球体积-梗死侧非梗死区脑组织体积）/正常侧大脑半球体积×100%。

1.5 电镜切片的制备和观察

大鼠脑缺血再灌注24 h后迅速断头取脑，取1 mm×1 mm×1 mm大小的新鲜脑组织，放入2.5%戊二醛中浸泡固定，2%四氧化锇后固定，梯度乙醇脱水，环氧树脂618包埋、超薄切片经醋酸铀、枸橼酸铅双重染色后，在80 kV条件下用JEM-1200EX型透射电镜观察结果。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 缺血后处理对大鼠神经功能缺失评分的影响

除假手术组外，各组动物清醒后出现不同程度的神经功能缺损，向患侧转圈、倾倒，不能站立、不能行走。I/R组和IP组神经功能缺损评分分别为2.50±0.55和1.33±0.52，IP组神经功能缺损较I/R组减轻，2组比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 缺血后处理对大鼠梗死体积的影响

TTC染色结果显示，I/R组和IP组右侧大脑半球可见脑梗死灶，I/R组和IP组梗死体积百分比分别为29.98%±8.08%和17.06%±1.85%，IP组梗死体积百分比明显小于I/R组（P<0.01）。

2.3 缺血后处理对大鼠神经元及其髓鞘变化的影响

正常神经元（图1A）核膜光滑，核仁清楚，核内染色质分布均匀，细胞质内有丰富线粒体、核糖体、粗面内质网、高尔基复合体、溶酶体等细胞器；髓鞘结构（图1D）正常，包绕轴突。I/R组缺血再灌注后神经元结构改变（图1B），核膜模糊，细胞质内线粒体嵴减少，线粒体外膜破损，线粒体空泡变性，细胞器减少、破坏；髓鞘（图1E）板层分离（箭头所示），髓鞘厚度变薄。IP组神经元（图1C）及髓鞘（图1F）结构改变介于二者之间。

3 讨论

近年来，研究发现缺血后处理对缺血再灌注损伤具有较强的内源性保护作用。2003年Zhao等［4］在犬的心肌缺血再灌注研究中发现，缺血后再灌注开始时，给予连续3次、每次30 s、再灌注30 s缺血的处理，可以减轻再灌注损伤。2006年Zhao等［5］发现缺血后处理同样具有脑保护作用，能够缩小脑梗死体积，减少神经元凋亡，促进神经功能恢复。缺血后处理是一种缺氧耐受现象，具有很强的神经保护作用。

神经元是构成神经系统结构和功能的基本单位，其对于缺血缺氧的耐受性差，在脑缺血再灌注发生后出现损伤，发生坏死，导致神经功能缺失。神经髓鞘是包裹在神经细胞轴突外面的管状外膜，呈层状包绕轴突，具有绝缘作用并提高神经冲动的传导速度，具有保护轴突的作用。在缺血再灌注后同样出现损害，出现髓鞘剥脱等改变。所以，如何保护神经元及其髓鞘、减少再灌注损伤是缺血再灌注后神经保护的重点。

细胞超微结构是反映细胞损伤程度最直观的指标。本实验应用透射电镜技术观察神经元及包绕其轴突的髓鞘改变，结果显示缺血再灌注可导致神经元、髓鞘不同程度损伤，IP组的损伤程度较I/R组减轻。缺血后处理减轻大脑皮层区神经元胞体、基底节区神经细胞髓鞘损伤，说明缺血后处理对神经元具有明显保护作用。以往报道多数关注神经元细胞胞体改变，而对髓鞘关注不多，髓鞘作为神经元细胞的一部分、脑白质的重要成分，在神经信号传递中有重要作用，在缺血再灌注过程中同样受到缺血再灌注损伤，其损害可破坏神经信号传导，出现神经功能缺失症状，从而对中枢神经系统的整体功能造成严重影响。本实验发现，缺血再灌注后基底节区髓鞘层状脱失，结构破坏，可导致神经信号传递障碍，而IP组髓鞘情况明显好于I/R组，说明缺血后处理可以保护缺血后处理的神经细胞髓鞘。实验结果还显示，大鼠缺血再灌注24 h IP组梗死体积及神经功能评分结果好于 I/R 组，宫利、张慧等［6，7］也有类似报道。证实IP能够减小缺血再灌注后梗死体积，促进神经功能恢复。所以，无论从微观神经细胞观察到宏观大体脑梗死体积测定，还是从解剖学结构到行为学神经功能评分，缺血后处理均能减轻再灌注损伤，表明IP对神经细胞具有保护作用。

而到目前为止，缺血后处理的脑保护机制还不是完全清楚。研究表明缺血后处理的脑保护作用可能与细胞凋亡［8］、炎症［9］、蛋白激酶途径［10］、PI3K/Akt途径［11］、MAPK 途径［12］、线粒体渗透性转化孔开放［13］、线粒体ATP敏感性钾通道开放［14］等有关。

综上所述，缺血后处理对于神经元及其髓鞘具有保护作用，能够减轻梗死体积，改善神经功能损伤。因为缺血后处理时机易于掌握、干预过程简单、可操作性强，对于脑梗死早期溶栓或栓子自溶血管再通后再灌注损害具有一定的保护作用，所以在未来一定具有广泛的临床应用前景，为临床脑保护提出新的研究方向。

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