中药复方对小鼠吗啡镇痛耐受影响的研究

曹 阳，王文萍，郭隽馥，田振国

疼痛是癌症患者特别是中晚期癌症患者的主要症状，它比死亡更令患者恐惧和不安。阿片作为一类历史悠久的镇痛药，吗啡及其衍生物是临床解除癌症晚期疼痛的主要药物。但是，吗啡及其他阿片制剂长期使用会导致耐受性和依赖性，极大限制了其在临床上的应用。吗啡镇痛耐受的机制已经研究了很多年，但至今尚不十分清楚。已经得到大多数人认同的机制有:受体数目变化、内吞;受体—蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)的活化;第二信号转导通路的代偿机制;受体基因表达变化等［1］。目前临床上并无十分有效的防治吗啡耐受的西药，临床所用多为吗啡受体阻断剂和作用稍弱一些的阿片类似物，但有不良反应多、降低吗啡效果、产生新的依赖等问题。用中药来解决吗啡在使用中出现的耐受现象，尚属于相对的空白阶段，但由于吗啡的耐受和依赖是同一药物作用下的两种不同表现方式和阶段，与之相比，中医、中药在解决药物依赖方面已经有200多年的历史，且中药具有多向调节、多功能、低毒无瘾的优势。故本实验研究中药复方对小鼠吗啡镇痛耐受的影响及其机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物来源 选取2008年12月—2009年5月健康雄性昆明种小鼠30只 (由辽宁中医药大学实验动物中心提供)，体质量21～23 g，替换掉其中尾部有缺陷的，随机数字表法分为3组，即吗啡组 (M组)、吗啡加中药复方组 (MB组)、正常对照组，每组10只。在安静、室温、正常光照的环境中适应性饲养1周，在此期间各笼条件均等、自由摄食饮水、无不良条件影响，1周后开始实验。

1.2 仪器与试剂 SHA－B恒温水浴振荡器 (常州国华电器有限公司)，MDF－136超低温冰箱 (日本SANYO)，CM1900石蜡切片机 (德国莱卡)，BS－51显微镜 (日本奥林帕斯)，WD－9413B紫外核酸分析系统 (北京六一仪器厂)，TGL－20M台式高速冷冻离心机 (湘仪仪器有限公司)，gene analyse软件 (北京六一仪器厂)。盐酸吗啡注射液 (沈阳第一制药厂，批号070705，0.5 ml∶5 mg)，大黄、木香等中药 (购自辽宁中医药大学附属医院众意愿大药房，药材由辽宁中医药大学任艳玲教授鉴定)，兔抗PKA(由武汉博士德生物工程有限公司提供，产品编号BA1354)，DAB显色试剂盒 (由武汉博士德生物工程有限公司提供，产品编号AR1022)，SABC免疫组化染色试剂盒 (由武汉博士德生物工程有限公司提供)。

1.3 方法

1.3.1 中药复方制备 精确称取大黄75 g、木香50 g、当归100 g，按下述操作浓缩至90 ml(2.5 g/ml)。当归加木香提取挥发油后的药液，水煎2次，1 h/次，合并煎液继续浓缩。木香用水回流装置提取挥发油 (提取挥发油所剩药液回收后与当归混合)。大黄水煎15 min并浓缩，按1∶1.5加入5%明胶，放置30 min后过滤，滤液中加入3～5倍的乙醇，过滤，除去明胶，滤液在70℃环境中使乙醇挥发完全。以上3种药液混合，浓缩至90 ml(2.5 g/ml)。

1.3.2 吗啡耐受模型的建立与给药 小鼠饲养1周后开始给药，M组每12 h皮下注射吗啡10 mg/kg;MB组每12 h皮下注射吗啡10 mg/kg并给予中药复方0.2 ml/只。以上各组均给药1周共15次。对照组未做任何处理。

1.4 甩尾潜伏期 (TFL)的测定 参照Yang等［2］的方法:第1次给药前测量各组的基础TFL。具体方法如下:将小鼠放入小鼠固定器中习惯5～10 min，将鼠尾末端3 cm置入52℃热水中，测量小鼠尾部置入瞬间至甩出作用时间。隔5 min再测1次，取两次平均值作为TFL。为避免烫伤，最长时间设为20 s，超过20 s以20 s计。随后，分别在第1、3、6、9、12、15次给药半小时后重复上述方法。

1.5 PKA免疫组化染色 待最后一次给药并测定TFL后，立即于冰面上固定小鼠四肢，与左心室内注射4%多聚甲醛，直到小鼠尾部直硬，说明小鼠脑组织已经固定。立刻剪下小鼠头部，取出脑皮质约100 mg用0.1低钠磷酸盐缓冲液 (MPBS)固定30～60 min→5℃组织脱水→包埋﹑切片→58～60℃烘烤→常规脱蜡至水→灭火内源性酶→热修复抗原→滴加5%牛血清蛋白封闭液 (BSA)→递加稀释的一抗 (兔抗IgG)→滴加生物素化山羊抗小鼠IgG→DBA显色→蒸馏水洗、脱水、透明、树脂胶封片。利用奥林巴斯BS－51显微镜40倍物镜进行观察、拍照。每张片子采集2个高倍视野图像，进行平均光密度测定。

1.6 统计学方法 采用SPSS 10.0统计学软件进行统计处理，计量资料以 (±s)表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 M组和MB组不同时间TFL比较 M组与MB组给药前、第1次、第3次给药后TFL比较，差异均无统计学意义 (P＞0.05);两组第6次、第9次、第12次、第15次给药后TFL比较，差异均有统计学意义 (P＜0.05，见表1)。

表1 M组和MB组不同时间TFL比较 (±s，s)Table 1 Comparison of TFL of different time between two groups

表1 M组和MB组不同时间TFL比较 (±s，s)Table 1 Comparison of TFL of different time between two groups

组别 只数 给药前 第1次 第3次 第6次 第9次 第12次 第15次47 9.40±0.19 7.52±0.33 6.44±0.39 MB组 10 4.22±0.43 16.65±1.01 16.21±0.40 15.14±0.37 13.27±0.45 10.44±1.02 8.81±1.18 t M组 10 4.30±0.49 16.59±0.83 16.18±0.46 14.04±1.1.333 0.333 0.500 2.717 3.148 2.651 2.631 P值值0.264 0.835 0.613 0.017 0.011 0.035 0.041

2.2 PKA免疫组化染色结果 正常小鼠脑皮质免疫组化染色显示PKA几乎没有表达，M组PKA表达有所增多，MB组小鼠脑皮质内PKA明显增多 (见图1)。M组PKA染色平均光密度值为 (0.3492±0.0055)，MB组为 (0.3230±0.0096)，二者差异有统计学意义 (t=2.83，P＜0.05)。

3 讨论

本研究结果显示，中药复方对小鼠吗啡耐受形成有抑制作用，同时使用吗啡和中药复方可以取得更好的镇痛效果。并且使用吗啡和中药复方的小鼠皮质中PKA明显低于单独使用吗啡的小鼠，这与前面TFL统计结果相一致，并进一步证明中药复方抑制小鼠吗啡耐受形成的机制可能与拮抗了吗啡对细胞内信号转导系统的影响有关。

图1 PKA免疫组化染色结果Figure 1 Immunohistochemical results of PKA

祖国医学认为阿片辛香苦涩性温，入十二经，功能行气止痛，发散走窜，敛肺止咳，固精止遗，涩肠止泻，有良好的临床疗效［3］。同时，阿片还有提携气血的兴奋作用。多服久用阿片会导致成瘾证。祖国医学关于阿片耐受和依赖的病机理论主要有气三焦受瘾说、血津液受损说、膜原受邪说、五脏六腑受瘾说、烟虫说等［4］几方面，其形成的主要机制是，烟毒内蕴，气血津液受损，毒淤互阻，脏腑阴阳失调，损阴及阳，气血淤滞，而见虚实互见，寒热错杂，诸病丛生的复杂病证。这些理论历经数百年的实践检验与不断完善，为治疗提供了充实的理论依据。吗啡耐受和依赖是同一药物作用下的两种不同表现方式和阶段，而中医、中药在解决药物依赖方面已经有200多年的历史。中医药学在长期的实践中逐渐形成了一套源于中医辨证论治理论，同时又以扶正祛邪为主要特色的治疗原则。目前，用于对抗吗啡耐受和依赖的中药主要有清热解毒类的中药及补气扶正、解痉镇痛类的中药。

由于吗啡耐受机制是多系统的、复杂的，不能指望单靶点的药物从根本上解决问题，所以中药的多系统、多靶点作用越来越受到青睐。但同时也存在着复方制剂药味多、处方庞大、基础研究薄弱、有效成分与无效成分混杂、剂型过于单一、质量难以控制等问题，同时也难以对药物进行深入的机制研究。基于以上，结合我国国情，发挥中医药的优势，必须用现代的科技方法从中药或复方中寻找治疗吗啡耐受的有效成分，进行深入研究，以研制出新药物用于临床，这也是中医药向现代化发展的要求。

1 Mercadante S，Fulffaro F.World Health Organization guidelines for cancer pain:a reappraisal［J］.Ann Oncol，2005，16(Suppl 4):132－135.

2 Yang W，Law PY，Guo X，et al.In vivo activation of a mutant muopioid receptor by antagonist:Future direction for opiate pain treatment paradigm that lacks undesirable side effect［J］.Proc Natl Acad Sci UAS，2003，1004(4):2117－2121.

3 宋树立，高学敏.中医辨证戒毒理论［J］.中国药物依赖性杂志，2000，9(3):170－171

4 朱伟.阿片类药物依赖的中医认识与探讨 ［J］.江西中医药，2002，10(5):29－30.