早期胃癌组织MMP-9、MLVD表达及临床意义

许俊龙，李玉红，张 杰，贾爱华，张学东，任玉波

(聊城市人民医院，山东 聊城 252000)

胃癌是最常见的胃肠道恶性肿瘤，易发生侵袭和转移。大量的研究表明，胃癌的侵袭转移是一个多基因多因素参与的多步骤的复杂的过程，会出现某些肿瘤蛋白基因会出现异常表达。基质金属蛋白溶解酶-9(MMP-9)是基质金属蛋白酶家族中的重要成员，可特异性地降解细胞外基质，其表达的增强与肿瘤的侵袭及转移有密切关系［1］。癌组织早期主要通过淋巴道转移，微淋巴管密度(MLVD)是反映肿瘤淋巴管生成的程度，进展期胃癌的研究成果很多，而早期胃癌较少，但可能更能反映胃癌的发生发展趋势。淋巴管特异性抗体D2-40被广泛运用于淋巴管生成的研究。2000年1月～2010年6月，我们采用免疫组化法检测了早期胃癌组织中的MMP-9蛋白表达及MLVD，探讨早期胃癌的可能发病机制。

1 资料与方法

1.1 材料 收集聊城市人民医院早期胃癌74例存档病理蜡块，所有患者均行胃癌根治术，术前未接受化疗和放射治疗。其中男58例，女16例;年龄33～83岁，平均61.58岁。乳头状及管状腺癌36例，低分化腺癌38例;局限于黏膜内者26例，侵及黏膜肌层者13例，累及黏膜下层者35例;其中6例可见胃浆膜外淋巴结转移。所有的病例均胃黏膜取材，取癌周围基本正常的胃黏膜作为对照组。全部标本经10%中性缓冲福尔马林固定，常规石蜡包埋，4μm连续切片，切片常规脱蜡，高温高压热抗原修复，严格按照免疫组化ElivisionTMplus试剂盒(福建迈新生物技术开发有限公司)操作步骤进行免疫组化染色。

1.2 MMP-9蛋白表达及MLVD检测 即用型鼠抗人MMP-9单克隆抗体和即用型D2-40单克隆抗体均购自福州迈新试剂公司。采用免疫组化ElivisionTMplus法。实验步骤按说明书进行。用已知阳性片作阳性对照，用PBS液代替一抗作阴性对照。结果判断:采用双盲法，由两位病理医师独立观察每张切片5个具有代表性的高倍视野，在组织切片中显示胞质染色为淡黄色至棕核色为阳性细胞标志，根据肿瘤细胞质或核的染色程度及染色细胞百分率进行分析评分:基本不着色为0分，着色淡黄者为1分，棕黄色者者为2分，棕褐色者为3分;着色细胞占计数细胞百分率≤5%为0分，6% ～25%为1分，26% ～50%为2分，51% ～75%为3分，≥75%为4分，两者相乘得分0～1分为阴性(－)，2～3分为弱阳性(+)，4～6分为中等阳性(++)，6分以上为强阳性(+++)。(+)～(+++)为阳性。D2-40阳性表达定位于淋巴管内皮细胞膜和胞质，呈棕黄色。MLVD结果的判定参考 Weidner的方法［2］，根据D2-40染色以阳性着色的单个内皮细胞或内皮细胞簇分别计为1个阳性微淋巴管(MLVD)。先在40倍光学显微镜光镜下确定5个着色密集的区域，200倍光学显微镜光镜下分别计数5个视野，取其均值。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。率的关系采用χ2检验，MMP9、D2-40表达的相关性分析采用Spearman等级相关分析法，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MMP-9表达及LMVD 见表1。

表1 不同组织中的MM-9的表达及其LMVD比较

2.2 MMP-9表达及LMVD与早期胃癌临床病理参数的关系 见表2。MMP-9蛋白阳性者LMVD值为(24.3 ±2.1)条/mm2，阴性者为(12.4 ±3.6)条/mm2(T=7.3657，P ＜0.01)。MMP-9 的表达程度与MLVD呈正相关(P＜0.01)。MMP-9蛋白阳性者LMVD 为(24.3 ±2.1)条/mm2，而 MMP-9 阴性者LMVD 值为(12.4±3.6)条/mm2，两者比较有统计学意义(T=7.3657，P ＜0.01)。

表2 MMP-9表达及LMVD与早期胃癌临床病理参数的关系

3 讨论

研究表明，恶性肿瘤细胞的扩散转移是其生物学本性之一，而肿瘤细胞的转移有着非常复杂的病理生理学因素，多种因素参与其中，正常组织细胞、肿瘤细胞和基质之间的粘附连接和脉管因素对其有重要影响，通常认为肿瘤的浸润转移先是由肿瘤细胞与基底膜粘附进而降解基底膜及细胞外基质，使肿瘤细胞突破自身基底膜，在间质中形成浸润灶，再以同样的方式穿破进入血液或淋巴，随血液或淋巴到达其他组织器官并再突破脉管基底膜，在局部增殖形成转移灶，因此肿瘤自身基底膜的完整性和肿瘤间质血管的形成及其密度在肿瘤浸润转移中起关键作用［3］，在参与恶性肿瘤侵袭和转移过程的主要酶类中，MMMPs是近年发现的较重要的一类，其中的MMP-9于近期颇受关注。MMP-9又称为Ⅳ型胶原酶或明胶酶B，属于明胶酶类，其作用底物为明胶蛋白、Ⅳ和Ⅴ型胶原、蛋白聚糖、弹性蛋白以及粘连蛋白等构成ECM的重要成份，因此，MMP-9以其能降解基底膜的构成蛋白而被认为与肿瘤的侵袭和转移有关［4］。本研究发现早期胃癌的MMP-9阳性表达率明显正常胃黏膜，提示早期胃癌中MMP-9蛋白高表达有实际意义，目前还没有合适的生物学指标可以准确的预测早期胃癌的发展和预后。MMP-9在早期胃癌的浸润、转移中起重要作用，有可能成为判断早期胃癌生物学行为的重要指标。

影响早期胃癌癌预后的因素很多，其中淋巴结转移是一个重要的因素。在大多数实体肿瘤中，癌细胞通过淋巴管向局部淋巴结扩散是转移性疾病中一个重要的早期事件。肿瘤的生长、侵袭和转移需要新脉管生成，肿瘤微脉管形成在许多临床肿瘤中已被证实是一个判断转移、预测预后的新指标。目前用于反映LMVD的标记物有多种，其中D2-40特异性最强［5］。目前以D2-40为标记来研究早期胃癌的LMVD的报道尚不多见。本研究以D2-40标记正常胃组织及早期胃癌组织中的LMVD，结果发现早期胃癌中心区和周边区均见明显增多的淋巴管，而且管腔扩张的有功能的的淋巴管和管腔闭锁的无功能的淋巴管未见有明显区别，与孙薇等［6］的研究结果不一致。本研究发现，早期胃癌组织中LMVD明显高于正常胃组织，有胃浆膜外淋巴结转移者LMVD明显高于无转移者，提示淋巴管生成与肿瘤淋巴结转移密切相关。通过淋巴管转移至引流区淋巴结可能是一些肿瘤初始转移阶段最主要的途径，癌细胞以“离散”方式存在于淋巴管内，能动性增加，侵袭性增强，易于突破基底膜，向周围组织浸润，并穿过淋巴管，发生淋巴结转移。提示高LMVD可能是早期胃癌淋巴转移的结构基础，通过D2-40检测的LMVD可以作为预测早期胃癌患者淋巴转移风险的指标。

总之，MMP-9和LMVD在早期胃癌中高表达，而且肿瘤组织分化越低，MMP-9表达越强，LMVD越多，淋巴结的转移性就越大，说明MMP-9有可能是促进肿瘤中微淋巴管生成的重要因素，因而检测早期胃癌中MMP-9和LMVD能为判断早期胃癌的预后提供新的途径。

［1］Turner HE，Nagy Z，Esiri MM，et al.Role of matrix-metalloprotei Nase-9 in pituitary tumor behavior［J］.J Clin EndocrinolMetab，2000，85(8):2931-2935.

［2］Weidner N.Intratumor microvessel density as a prognostic factor in cancer［J］.Am J Pathol，1995，147(1):9-19.

［3］Egeblad M，Werb Z.New functions for the matrix metallo proteinases in cancer progression［J］.Nat Rev Cancer，2002，2(3):161

［4］Nielsen BS，Sehested M，Kjeldsen L，et al.Expression of matrix metalloproteinase-9 in vascular pericytes in human breast cancer［J］.Lab Invest，1997，77(4):345-355.

［5］van der Auwera I，van den Eynden GG，Colpaert CG，et al.Tumor lymphangiogenesis inflammatory breast carcinoma:a histo-morpho metric study［J］.Clin Cancer Res，2005，11(21):7637.

［6］孙薇，周晓军，马恒辉，等.胃腺癌组织中微淋巴管密度的检测及其临床病理意义［J］.肿瘤防治研究杂志，2008，35(7):514-523.