卷烟烟气中性红细胞毒性试验不确定度评定

黄海涛,管 莹,周 岚,高 茜,米其利,李雪梅,夭建华(云南烟草科学研究院,云南昆明650106)

卷烟烟气中性红细胞毒性试验不确定度评定

黄海涛,管 莹,周 岚,高 茜,米其利,李雪梅,夭建华
(云南烟草科学研究院,云南昆明650106)

研究了烟草及烟草制品烟气安全性生物学评价中性红细胞毒性试验的不确定度评定方法,分析和识别测量过程中不确定度的来源,较为全面地评定了测量不确定度。结果表明,测量结果的不确定度主要来源于测量重复性所引起的不确定度。

不确定度评定;中性红细胞毒性试验;烟草及烟草制品;烟气安全性;生物学评价

测量不确定度在计量标准考核中具有核心作用,它是评价检测结果可信性、可比性和可接受性的重要指标,中国实验室国家认可委(CNAL)要求经其认可的检测实验室必须建立测量不确定度的评定程序,并有能力对每一项数值要求的测量结果进行测量不确定度的评定[1,2]。目前,烟草科技工作者已按照CNAL的要求对卷烟部分物理指标的测定和烟草中一些化学成分的测定进行了不确定度的评定,但是关于烟草及烟草制品生物学检测不确定度的评定却未见报道。近10年来,中性红细胞毒性试验方法被国内外烟草公司广泛用于烟草及烟草制品的安全性评价。为了在测量数据的处理、测量结果的表达和测定结果质量评定等方面更具科学性和权威性,作者根据《测量不确定度评定与表示》(JJF 1059-1999)的相关规定,对烟草及烟草制品烟气安全性生物学评价中性红细胞毒性试验[3]的不确定度进行了测量和评定。

1 实验

1.1 材料、试剂及仪器

中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞),中国科学院昆明细胞库。

DMEM细胞培养基(选择含L-谷氨酸、不含丙酮酸钠的类型)、RPM1640细胞培养基、中性红染料、青霉素-链霉素混合液(1000 U·m L-1)、胰蛋白酶,以上物质均在(4±1)℃保存;胎牛血清,(-20±1)℃保存。

二甲基亚砜(细胞培养级)、台盼蓝(分析纯)、甲醛(分析纯)、十二烷基硫酸钠(分析纯)、冰醋酸(分析纯)、无水乙醇(分析纯)。

二级生物安全柜、倒置显微镜、二氧化碳培养箱[(37±1)℃,5%CO2]、酶标仪、高压蒸汽灭菌锅、电子天平、p H计、微孔板振荡器。

1.2 测定原理

中性红以离子扩散方式进入细胞膜,并与溶酶体基质中的阴离子部分结合。中性红进入并在细胞内积聚的过程要求有完整的细胞膜,当细胞膜和溶酶体膜中毒受伤时就会导致中性红的进入下降。细胞内中性红的摄入量与培养体系中细胞的存活率呈正相关。

在进行卷烟烟气安全性生物学评价的中性红细胞毒性试验时,用受试样品处理CHO细胞,向处理后的CHO细胞中加入中性红溶液,用酶标仪在540 nm波长下测定空白、样品、对照物中含有萃取中性红的溶液的吸光度值,从而计算出细胞抑制率和半数细胞致死剂量。

1.3 测定过程

测定过程如下:

1.4 数学模型

IC50=lg[lg B+d×(b-50)/(b-a)]-1

式中:ODn、OD0、ODc为样品、空白样品、细胞对照OD值;B为高于50%抑制率的剂量;d为两个相邻剂量的对数差;b为B剂量的抑制率(＞50%);a为A剂量的抑制率(＜50%)。

2 结果与讨论

2.1 不确定度来源识别

由于条件所限,烟气样品制备过程和CHO细胞悬液制备过程中的不确定度在此不作考虑。根据本方法的测定原理和数学模型,IC50主要由细胞抑制率计算得到,细胞抑制率由吸光度值计算得到,而吸光度值由酶标仪自动测定完成。可见本方法的测量不确定度主要与仪器准确度、仪器示值误差产生的不确定度和样品重复操作过程引起的吸光度值的不确定度有关。由仪器校准结果可知,仪器的准确度较好(吸光度值准确度≤±0.03),故由仪器准确度引入的不确定度分量可以忽略不计。综上所述,将从仪器示值误差产生的不确定度和样品重复操作过程引起的吸光度值的不确定度对本方法的测量不确定度进行评估。

2.2 不确定度的评定

2.2.1 样品吸光度值引入的不确定度分量

2.2.1.1 样品吸光度值测量重复性引入的标准不确定度分量

共进行了7次重复性试验,所得样品吸光度值分别为0.429、0.427、0.468、0.507、0.454、0.560、0.316,平均吸光度值为0.452。

单次的测量标准偏差为:

在日常分析中,测定两份样品报告平均值,故平均值的标准偏差应为:

测量重复性引入的相对标准不确定度为:

2.2.1.2 酶标仪示值误差引入的不确定度分量

按照JJG 861-2007《酶标分析仪检定规程》对仪器进行检定,获得线性误差为2.5%,按矩形(均匀)分布计算得到酶标仪示值误差引入的相对不确定度为: 2.2.1.3 两种分量合成得到样品吸光度值引入的不确定度

2.2.2 空白样品吸光度值引入的不确定度分量

2.2.2.1 空白样品吸光度值测量重复性引入的标准不确定度分量

共进行了7次重复性试验,所得空白样品吸光度值分别为0.0715、0.0722、0.0673、0.0713、0.0715、0.0673、0.0753,平均吸光度值为0.0709。

单次的测量标准偏差为:

在日常分析中,测定两份样品报告平均值,故平均值的标准偏差应为:

测量重复性引入的相对标准不确定度为:

2.2.2.2 酶标仪示值误差引入的不确定度分量

按照JJG 861—2007《酶标分析仪检定规程》对仪器进行检定,获得线性误差为2.5%,按矩形(均匀)分布计算得到酶标仪示值误差引入的相对不确定度为:

2.2.2.3 两种分量合成得到空白样品吸光度值引入的不确定度

2.2.3 细胞对照吸光度值引入的不确定度分量

2.2.3.1 细胞对照吸光度值测量重复性引入的标准不确定度分量

共进行了7次重复性试验,所得细胞对照样品吸光度值分别为1.142、1.148、1.124、1.231、1.232、1.205、0.823,平均吸光度值为1.129。

单次的测量标准偏差为:

在日常分析中,测定两份样品报告平均值,故平均值的标准偏差应为:

测量重复性引入的相对标准不确定度为:2.2.3.2 酶标仪示值误差引入的不确定度分量

按照JJG 861-2007《酶标分析仪检定规程》对仪器进行检定,获得线性误差为2.5%,按矩形(均匀)分布计算得到酶标仪示值误差引入的相对不确定度为:

2.2.3.3 两种分量合成得到细胞对照吸光度值引入的不确定度

2.2.4 细胞抑制率计算公式中分子(ODn-OD0)的合成相对不确定度

2.2.5 细胞抑制率计算公式中分母(ODc-OD0)的合成相对不确定度

2.2.6 细胞抑制率的合成相对不确定度

2.2.7 细胞抑制率的合成标准不确定度

当剂量为100μg·m L-1时的7次抑制率测定结果分别为66.56%、66.99%、62.08%、62.41%、67.04%、56.65%、67.87%,平均值为64.23%。

2.2.8 扩展不确定度

取包含因子k=2,扩展不确定度为:

按照该方法测定受试样品的细胞抑制率,报告两份样品测定结果的平均值,细胞抑制率为64.23%时,其扩展不确定度为18.62%。

2.3 讨论

通过以上计算和分析可以看出,烟草及烟草制品烟气安全性生物学评价中性红细胞毒性试验的不确定度主要来源于测量重复性所引起的不确定度,仪器示值误差产生的不确定度很小。其中,空白样品吸光度值测量重复性引入的不确定度(2.61%)明显小于细胞对照吸光度值测量重复性引入的不确定度(8.21%),而样品的加入对吸光度值测量重复性引入的不确定度(11.00%)仅稍高于细胞对照吸光度值测量重复性引入的不确定度(8.21%)。也就是说在该试验中细胞的数量和状态对测量不确定度的影响是最大的,要想进一步降低测量的不确定度需在试验过程中对细胞状态进行有效的监控。

3 结论

研究了烟草及烟草制品烟气安全性生物学评价中性红细胞毒性试验的不确定度评定方法,分析和识别测量过程中不确定度的来源,较为全面评定了测量不确定度。结果表明,测量结果不确定度主要来源于测量重复性所引起的不确定度。

[1] 国家质量技术监督局计量司.测量不确定度评定与表示指南[Z].北京:中国计量出版社,2000.

[2] 中国实验室国家认可委员会.化学分析中不确定度的评估指南[Z].北京:中国计量出版社,2002.

[3] 中国烟草总公司企业标准YQ2-2011,烟草及烟草制品烟气安全性生物学评价第1部分:中性红细胞毒性法[S].

The Uncertainty Assessment of Neutral Red Uptake Assay of Tobacco Smoke

HUANG Hai-tao,GUAN Ying,ZHOU Lan,GAO Qian,MI Qi-li,LI Xue-mei,YAO Jian-hua (Yunnan Academy of Tobacco Science,Kunming 650106,China)

The uncertainty assessment method of tobacco and tobacco products-biological evaluation of tobacco smoke-neutral red uptake assay was studied in this article.The factors of uncertainty during the measurement were analyzed and identified.It presented a relatively comprehensive assessment of measurement uncertainty.The results showed that the uncertainty was mainly caused by the uncertainty of the determination repeatability.

the uncertainty assessment;neutral red uptake assay;tobacco and tobacco products;tobacco smoke safety;biological evaluation

TS 416

A

1672-5425(2012)11-0068-03

10.3969/j.issn.1672-5425.2012.11.019

云南省中烟工业公司项目(2011JC02),云南省烟草化学创新团队建设项目(2009CI014)

2012-07-05

黄海涛(1975-),女,福建人,硕士,助理研究员,主要从事烟用添加剂安全性评价研究,E-mail:1696754981@qq.com;通讯作者:夭建华,副研究员,E-mail:jhyao_2007@126.com。