粘质沙雷氏菌代谢产物灵菌红素的鉴定

朱雄伟,徐智鹏,苏腾甲,陈杏洲,张 楠,张佑红,李卫朋(武汉工程大学化工与制药学院绿色化工过程省部共建教育部重点实验室,湖北武汉430074)

粘质沙雷氏菌代谢产物灵菌红素的鉴定

朱雄伟,徐智鹏,苏腾甲,陈杏洲,张 楠,张佑红,李卫朋
(武汉工程大学化工与制药学院绿色化工过程省部共建教育部重点实验室,湖北武汉430074)

从柠檬酸厂糖化车间酸性土壤中筛选得到一株产红色素的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)ZSG,菌株发酵液经酸性甲醇萃取、浓缩、硅胶柱层析、薄层色谱和柱色谱等分离纯化后,得到灵菌红素纯品,并采用紫外可见吸收光谱、红外光谱、液质联用分析对其结构进行了表征。

粘质沙雷氏菌;灵菌红素;紫外可见吸收光谱;红外光谱;液质联用

灵菌红素,又名灵菌素、灵杆菌素,是一类含甲氧基吡咯骨架结构的天然红色素,是由多种放线菌、沙雷氏菌、链霉菌属、假单胞菌属等产生的次级代谢产物[1,2]。根据其侧链基团结构的不同,可分为灵菌红素、间环丙菌素、十一烷基灵菌红素、壬烷基灵菌红素和环丙烷灵菌红素等系列结构类似物。

灵菌红素呈暗红色,绿色反光,熔点151～152℃,属于脂溶性色素,易溶于甲醇、丙酮、氯仿、苯、DMF和DMSO,几乎不溶于水[3]。灵菌红素对光不稳定,需要避光保存。灵菌红素受p H值的影响较大,在酸性环境中能保存较长的时间,在碱性条件下则不稳定[4]。

虽然目前关于灵菌红素的化学合成研究取得了一定的成果,但受其化学合成工艺的复杂性等多种因素的限制以及人们对绿色天然的追求,目前灵菌红素的生产以生物合成为主。因此对产灵菌红素菌种的开发及发酵工艺的研究具有非常重要的意义。

作者从柠檬酸厂糖化车间酸性土壤中筛选得到一株产红色素的粘质沙雷氏菌ZSG,并对其发酵培养的代谢产物进行了分析。

1 实验

1.1 菌株与培养基

粘质沙雷氏菌,从柠檬酸厂糖化车间酸性土壤中筛选获得并保藏。

固体培养基:蛋白胨1%,牛肉膏0.5%,氯化钠0.5%,琼脂2%。

种子培养基:蛋白胨1.5%,蔗糖1%,吐温-80 1%,NaCl 0.5%。

1.2 试剂与仪器

Agar琼脂粉,日本;蛋白胨;其它化学试剂均为分析纯。

UV1800型紫外可见分光光度计;Nexus470 FTIR型智能傅立叶红外光谱仪;LTQ XL型高效液相色谱-线性离子阱质谱联用仪。

1.3 方法

1.3.1 菌株培养

将菌株在装液量50 m L/250 m L、摇床转速160 r ·min-1、29℃下培养36 h后,取发酵液离心(10 000 r·min-1,10 min),弃上清,收集菌体,用蒸馏水洗涤2次。

1.3.2 红色素的分离纯化

将上述收集的菌体先用酸性甲醇萃取,萃取液经浓缩去溶剂后,再用乙酸乙酯溶解,低温静置;将沉淀混合物经硅胶柱层析(氯仿和乙酸乙酯洗脱)、去溶剂得到灵菌红素粗产品;最后用薄层色谱和柱色谱进行再分,即得到灵菌红素纯品。

1.4 结构表征[5～8]

分别采用紫外可见吸收光谱、红外光谱、液质联用分析对所得灵菌红素进行结构表征。

2 结果与讨论

2.1 紫外光谱分析

将所得的灵菌红素溶解于甲醇中,分别用HCl、 NaOH调p H值为3、10,在200～800 nm波长范围内进行全波段扫描,结果见图1。

图1 灵菌红素的紫外可见吸收光谱Fig.1 UV-Vis Absorption spectra of prodigiosin obtained

由图1可知,酸性条件下,所得灵菌红素在535 nm左右有最大吸收峰,溶液为鲜红色;碱性条件下,所得灵菌红素在470 nm左右有最大吸收峰,溶液为橘黄色,与已报道的灵菌红素的吸收光谱一致[9]。

2.2 红外光谱分析

采用液膜法测定灵菌红素的红外光谱,红外光谱能量为40 mW,波数范围为400～4000 cm-1,结果见图2。

图2 灵菌红素的红外光谱Fig.2 FTIR Spectrum of prodigiosin

由图2可知,所得灵菌红素的红外光谱的主要吸收峰分别为:3440.0 cm-1、2981.1 cm-1、2843.9 cm-1、1657.7 cm-1、1241.3 cm-1、1032.96 cm-1、713.0 cm-1。其中,3440.0 cm-1处强而稍宽的峰为N -H的伸缩振动峰;2981.1 cm-1处弱而尖的峰为CH(甲基、亚甲基、次甲基)的伸缩振动峰;1657.7 cm-1处稍弱的峰为环内C=C的伸缩振动峰;1032. 96 cm-1处强而尖的峰为C-O、C-N的伸缩振动峰; 713.0 cm-1处为(CH)n的平面摇摆振动吸收峰;这与文献报道的灵菌红素红外光谱相一致[10]。

2.3 液质联用图谱分析

色谱条件:色谱柱为Liehrospher C18column (4.6 mm×250 mm),流动相为80%甲醇的水溶液,流速1 m L·min-1,柱温30℃。

质谱条件:ESI-MS锥孔电压60 V,毛细管电压3.88 k V,离子源温度120℃,脱溶剂温度300℃。

所得灵菌红素的液质联用图谱如图3所示。

图3 灵菌红素的液质联用图谱Fig.3 LC-MS Spectra of obtained prodigiosin

由图3a可知,在MS图谱中有m/z 324.19[M+ H],据此判断该色素的相对分子质量为323.19,与灵菌红素分子量(C20H25N3O,M=323.1968)相同[11]。

由图3c可知,通过LC-MS还可以得到离子碎片m/z 308、m/z 292、m/z 266、m/z 252、m/z 238、m/z 161和m/z 149等,与报道的灵菌红素碎片数据基本一致[12]。

3 结论

从柠檬酸厂糖化车间酸性土壤中筛选得到一株产红色素的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)ZSG,菌株发酵液经酸性甲醇萃取、浓缩、硅胶柱层析、薄层色谱和柱色谱等分离纯化后,得到灵菌红素纯品。经紫外可见吸收光谱、红外光谱、液质联用分析对其结构进行了表征。

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Identification of Metabolite Prodigiosin of Serratia Marcescens

ZHU Xiong-wei,XU Zhi-peng,SU Teng-jia,CHEN Xing-zhou,ZHANG Nan,ZHANG You-hong,LI Wei-peng (Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of Education,School of Chemical
Engineering and Pharmacy,Wuhan Institute of Technology,Wuhan 430074,China)

A red pigment-producing strain Serratia marcescens ZSG was isolated from the acidic soil of a citric acid plant saccharification workshop.By acidic methanol extraction,concentration,silica gel column chromatography,thin-layer chromatography and column chromatography,the pure prodigiosin was separated and purified from the fermentation broth,and its structure was characterized by UV-Vis,IR and LC-MS.

Serratia marcescens;prodigiosin;UV-Vis absorption spectrum;IR;LC-MS

TQ 920.6 O 657.7

A

1672-5425(2012)11-0080-03

10.3969/j.issn.1672-5425.2012.11.022

国家自然科学基金资助项目(20876120)

2012-07-05

朱雄伟(1973-),男,湖北咸宁人,博士,讲师,研究方向:生物工程与生物技术,E-mail:zhuslx@163.com。