新城疫病毒核酸检测标准物质研究

谷 强，张 伟，高志强，张鹤晓，刘 环，蒲 静，乔彩霞，张利峰

（北京出入境检验检疫局，北京 100026）

鸡新城疫是强毒力新城疫病毒引起的鸡的急性、热性、高度接触性的败血性传染病。新城疫病毒可自然感染人、猪和犬等哺乳动物，严重危害养鸡业[1]。我国主要采用疫苗控制新城疫的流行，疫苗所采用的毒株大多是新城疫弱毒株。疫苗免疫后，在一定时间内鸡群中存在弱毒疫苗株，因此，快速的诊断和鉴别检测新城疫强毒株和疫苗株对于防控新城疫具有十分重要意义。

随着新城疫病毒致病力分子生物学基础的深入研究，使得核酸检测鉴别毒株毒力强弱成为可能。许多学者根据病毒F0切割位点的特定序列建立了核酸检测方法并研制出试剂盒。目前各检测单位在采用分子生物学方法对新城疫病毒中强毒株进行鉴别检测时，由于人员问题、设备问题或者采用的方法和试剂不尽相同，结果有时会有差异。因此研制相关核酸检测标准物质通过测量审核或能力验证的方式对设备、人员以及方法和试剂等进行验证或考核具有重要意义。

本研究采用制备体外转录RNA制备新城疫病毒核酸检测标准物质，不涉及生物安全问题，在实际检测中，可在逆转录和PCR扩增2个方面进行质量控制。一方面为相关检测实验室在鉴别这2类毒株提供参比标准品，可用于评定实验室鉴别诊断中强毒力新城疫病毒和新城疫病毒疫苗毒的能力。另一方面可用于实验室进行质量控制和量值传递提供参比品。研制的标准物质目前已经用于实验室的能力验证计划和测量审核，在实践中证实具有很好的适用性。

1 材料和方法

1.1 仪器 ROCHE公司的LightCycler 1.0，LightCycler 2.0，Roche 480荧光PCR仪，ABI7900HT荧光PCR仪。

1.2 试剂

1.3 新城疫病毒F48E9株核酸，新城疫病毒lasota株核酸，本实验室保存。

1.4 新城疫病毒 F48E9株和Lasota株F基因，M因和HN基因的扩增、克隆和序列分析设计以下6对引物，用于扩增含完整ORF的6个基因片段。

表 1 扩增新城疫病毒F48E9，F基因、HN基因和M基因的引物名称、序列

表 2 扩增新城疫病毒Lasota，F基因、HN基因和M基因的引物名称、序列

扩增产物纯化后，将目的片段克隆入Promega公司的pGEM-T载体，挑取多个克隆进行测序，选取序列正确的克隆命名为pGEM-T-swF（F48E9），pGEM-T-swM（F48E9）和 pGEM-T-swHN（F48E9），pGEM-T-swF（Lasota），pGEM-T-swM（Lasota）和pGEM-T-swHN（Lasota）。

1.5 T7体外转录病毒RNA

对上述重组质粒序列进行分析后，结果表明目的片段中不含有PvuII位点，而载体含有PvuII位点，因此完全酶切后，可以切出含T7启动子的线性化DNA片段[2]。因此选用该酶对质粒进行线性化。用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒进行体外转录；体外转录体系为 5×buffer 20 µL，25 mmol/L rNTPs 20 µL，线性化DNA10 µg，酶混合物10 µL，补加无核酸酶的水至100 µL。反应条件为37 ℃温浴5 h。将体外转录产物用DNase除去其中的DNA模板后，然后用TRIZOL按照说明重新提取RNA，以去除体系中的杂蛋白与各种离子，将RNA沉淀溶于1.0 mL的无RNA酶的灭菌水中，分装，20 µL/管，-80 ℃冻存，即得到制备好的6种RNA片段。

1.6 标准品制备与初步定值

RNA的水溶液在-80℃条件下可保存一年左右，但在-20 ℃条件下只能保存一周左右，在室温和4 ℃条件下很容易降解，我们曾尝试将不同拷贝数的RNA置于75%的乙醇溶液中，进行均匀性和稳定性试验，取得良好效果。但由于RNA在75%的乙醇溶液中呈颗粒悬浮分散。因此其均匀状态还可进一步改进，采用商品化的RNA提取裂解液TRIZOL（INVITROGEN公司产品）作为基质，分散RNA，结果显示RNA样品4 ℃可在其中稳定存在6个月以上。

取制备的体外转录RNA用无RNA酶的灭菌水分别作200倍稀释，测定其260 nm和280 nm的吸光度值（A260和A280），计算根据测序结果，利用DNAMAN（Version 6）计算出单链模板的分子量（MW）。按照公式计算初步拷贝数[3]：拷贝数=A260×40×200× 微升数 ×10-9×6.02×1023次 / MW

根据计算结果，将各个片段应用稀释液（TRIZOL:水＝3:1）稀释至3×108拷贝数/mL。将新城疫病毒Lasota株 M，F和HN 3种RNA片段和新城疫病毒F48E9株M基因，F基因和HN基因分别进行等体积混合，然后分别进行分装，1 mL/管。

1.7 均匀性检验

选择每种标准品的M、F、HN基因作为目标进行均匀性检验。随机分别抽取10管制备的标准品，加入250 µL氯仿，充分混合后，按照GB/T19438.1—2004 所述方法提取RNA。应用建立的新城疫病毒通用荧光RT-PCR方法在重复条件下在一次试验中分别测试10份RNA样品，手动设置基线，获取Ct值。结果数据用单因子方差分析进行统计处理。

1.8 稳定性检验

选择每种标准品的M、F、HN基因作为目标进行稳定性检验。随机分别抽取制备的标准品，在以下每种条件下放置10支[4]：（1）室温20~25 ℃，相对湿度20%~50%，14 d取出进行测试；（2）冰箱冷藏温度2~8 ℃，6个月取出进行测试；（3）-20 ℃，1年后取出进行测试；（4）对照，-80 ℃，长期放置。将纯化的质粒pGEM-T-swM（Lasota）通过测定其260 nm和280 nm的吸光度值，通过分子量计算出其拷贝数，进一步系列稀释制成一系列外标品。应用建立的新城疫病毒通用荧光RT-PCR方法来间接测定上述RNA的拷贝数。

采用两样本均数显著性检验－t检验进行统计分析。

1.9 标准品协作标定

采用委托8家外部实验室协作标定的方法来对制备的标准品进行定值。定值方法为将纯化的质粒pGEM-T-swF（F48E9），pGEM-T-swM（F48E9）和pGEM-T-swHN（F48E9），pGEM-T-swF（Lasota），pGEM-T-swM（Lasota）和pGEM-T-swHN（Lasota）通过测定其260 nm和280 nm的吸光度值，通过分子量计算出拷贝数，进一步系列稀释制成一系列外标品。应用建立的新城疫病毒通用荧光RT-PCR方法，新城疫病毒中强毒力荧光RT-PCR检测方法来间接测定标准品的拷贝数。

1.10 不确定度分析

通过对实际检测过程进行分析，确定标准品的总不确定度。应用A类评定方法进行评定[5]。

2 结果

2.1 新城疫病毒F48E9株 F基因、M基因和HN基因的扩增、克隆和测序

采用表1的引物，成功扩增了新城疫病毒F48E9株 F基因、M基因和HN基因，见图1。

扩增产物纯化后，成功克隆入pGEM－T载体，对多个克隆测序后，选取序列正确的克隆命名为pGEM－T－swF（F48E9），pGEM－T－swM（F48E9）和pGEM－T－swHN（F48E9）。

2.2 新城疫病毒Lasota株 F基因、M基因和HN基因的扩增、克隆和测序

采用表2的引物，成功扩增了新城疫病毒Lasota株 F基因、M基因和HN基因，见图2。

扩增产物纯化后，成功克隆入pGEM－T载体，对多个克隆测序后，选取序列正确的克隆命名为pGEM－T－swF（Lasota），pGEM－T－swM（Lasota）和pGEM－T－swHN（Lasota）。

2.3 T7体外转录病毒RNA

用PvuII酶切上述质粒，均能切出含T7启动子和目的DNA的片段。因此选用该酶对质粒进行线性化。经T7试剂盒进行体外转录获得大量RNA，除去其中的DNA模板后，然后用TRIZOL按照说明重新提取RNA，获得6种RNA片段。

2.4 标准品制备与初步定值

取制备的体外转录RNA用无RNA酶的灭菌水分别作200倍稀释，测定其260 nm和280 nm的吸光度值（A260和A280），结果显示A260和A280的比值均在2.0±0.1范围内，表明RNA纯度较高。根据计算结果，将各个片段应用稀释液（TRIZOL:水＝3:1）稀释至3×108拷贝数/mL。将新城疫病毒F48E9株F基因、M基因和HN基因 3种RNA片段和新城疫病毒Lasota株 F基因、M基因和HN基因分别进行等体积混合，然后分别进行分装，1 mL/管。

2.5 均匀性检验结果

选择每种标准品的M基因作为目标进行均匀性检验。应用建立的新城疫病毒中强毒力荧光RT-PCR方法在重复条件下在一次试验中分别测试10份RNA样品，手动设置基线，获取Ct值。结果数据用SPSS软件进行单因素方差分析统计处理。结果见表3，表4和图3。

表3 新城疫病毒F48E9株标准品均匀性试验方差分析结果

表 4 新城疫病毒F48E9株与新城疫病毒Lasota株标准品t检验统计结果

按临界值F 0.05（9、10）=3.14。计算的F值分别为0.6、0.87、0.445、2.049、2.526和1.401，该值＜F临界值，这表明在0.05显著性水平时，样品中目的核酸片段含量是均匀的。

2.6 稳定性检验结果

不同条件下放置制备的标准品的检测结果见表4。将检测组与对照组（-80 ℃）数据分别作两样本均数显著性检验－t检验进行统计分析，结果表明检测组与对照组差异均无统计学意义（P>0.05）。-20 ℃1年检测结果平均值分别为为1.09×108拷贝数/mL和1.10×108拷贝数/mL。

2.7 标准物质协作标定结果

采用委托8家外部实验室协作标定的方法来对制备的标准品进行定值。定值方法为通过制备一系列质粒外标品。应用建立的新城疫病毒中强毒力荧光RT-PCR方法来间接测定标准品的拷贝数，经统计分析，取平均值作为定值结果，结果见表5。

2.8 不确定度分析

通过对实际检测过程进行分析，确定标准品的总不确定度，包括：分析测定误差、RNA提取过程的误差和样本不均匀性引起的误差。可以通过A类评定方法进行评定。协作标定的标准差涵盖了以上不确定度分量。因此可作为本批标准品各个基因片段的不确定度（表5）。

表 5 新城疫病毒F48E9株与新城疫病毒Lasota株标准品协作标定结果

3 结论与讨论

鸡新城疫是鸡的急性、热性、高度接触性的败血性传染病。其临床特征为败血症的症候以及伴随消化紊乱、呼吸障碍和神经症状。病理剖检常出现消化道粘膜出血和坏死性变化。

本病于1926年首先发现于印度尼西亚和英国的新城，故名新城疫。以后世界各地尤以亚洲各国相继发生，为了与欧洲鸡瘟相区别，故又名亚洲鸡瘟，或称伪鸡瘟，我国俗称“鸡瘟”。我国把新城疫作为强制免疫的项目之一。疫苗所用的毒株为Lasota株。

因此在实际诊断与检测中，采用核酸扩增方法进行鉴别时，必须进行仔细的序列比对分析。

目前市场上虽然有许多新城疫病毒检测试剂，但缺乏参比品进行评价和验证。本研究通过选择2个毒株最具检测意义的全长核酸片段制备标准品并进行定值研究。均一性检测结果选择其中的M基因片段进行荧光RT-PCR检测，结果显示瓶间变异系数分别为3.06%和3.15%，小于5%。制备的标准品在稳定性方面，分别作了室温14天，2~8 ℃6个月及-20 ℃保存一年的含量变化监测，其结果与对照样本均（-80 ℃冻存样本）无明显差异，表明制备的标准物质可以满足实际应用。我国的标准物质管理办法规定定值结果一般表示为：标准值±总不确定度。要明确指出总不确定度的含义。本研究中标准值的不确定度由以下几部分组成：分析测定误差、RNA提取过程的误差和样本不均匀性引起的误差。因此采用A类评定方法进行了简单评定。

由于该定值制备物为RNA，在扩增检测中，可在逆转录和PCR扩增两个方面进行质量控制，在实际检测中具有很好的适用性。一方面为相关检测实验室鉴别这2类毒株提供参比标准品，可用于评定实验室鉴别诊断中强毒力新城疫病毒和新城疫病毒疫苗毒的能力。另一方面可为实验室进行质量控制和量值传递提供参比品。因此对于进一步推进新城疫病毒核酸检测的标准化和规范化具有重要意义。

[1] Of fi ce International des Epizooties.Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals（2008）[M].Paris，France：Of fi ce International des Epizooties.www.oie.int.

[2] 高志强，张鹤晓，乔彩霞，等.2009大流行H1N1流感病毒与经典H1N1猪流感病毒核酸扩增检测标准物质研究[J].计量学报，2010，31（z1）：9-14.

[3] 王露楠，吴健民，李金明.丙型肝炎病毒核酸检测的国家标准物质的研制[J].中华检验医学杂志，2006，29（4）：354-357.

[4] 王莹，丁肖青，朱胜.梅毒螺旋体TpN47基因分析及实时荧光定量PCR检测方法的建立[J].中国人兽共患病学报，2012，28（2）：135-138.

[5] 朱佳，孙杰.液相色谱法测定果汁中糖精钠的不确定度研究[J].食品研究与开发，2012，32（2）：156-157.