张 康 ,龚振华 ,李 蕾 ,王洪伟 ,李玉清 ,张丽娟 ,王丽萍,庄青叶,于建敏,李金平,刘国庆
(1.中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛 266032;2.青岛易邦生物股份有限公司,山东青岛 266032;3.诸城市畜牧兽医管理局,山东诸城 262200;4.胶南市兴牧科技服务中心,山东胶南 266400)
鸡弯曲菌病又称为鸡弧菌性肝炎,主要由空肠弯曲菌感染引起的幼鸡或成年鸡传染病。本病以肝出血坏死性肝炎伴发脂肪浸润,主要呈慢性经过为特征,影响鸡的生产性能,可以给养鸡业造成较大的经济损失。传统的细菌学分离方法是检测鸡弯曲菌病的主要方法[1],但因该菌培养需要微厌氧培养系统、营养条件苛刻、增菌分离及生化鉴定所需时间长,使得该方法在实际操作中显得非常繁琐与不便。临床实践中,有时需要采用空肠弯曲菌快速检测方法进行临床诊断。近年来,PCR检测方法以其特异性强、灵敏度高和快速简便等优点,已经在鸡弯曲菌病的检测中得到了广泛的应用[2-5]。我们采用Nested-PCR方法,对某鸡场发生的空肠弯曲菌感染鸡进行了快速诊断研究,现将结果报告如下。
1.1 PCR对照样品
阳性对照样品:空肠弯曲菌(ATCC33560)由中国动物卫生与流行病学中心保存。
阴性对照样品:市场上购买的健康鸡肝组织。
1.2 引物
采用高正琴等[6]报道的2对针对弯曲菌fl a A区的 Nested-PCR 的 引 物,F1:5'-GGAGGATCCATGGGA TTTCGTATTAAC-3';R1:5'-TTTGGATTCCTACTGT AGTAATCTTAA-3'。F1+R1 扩 增 长 度 为 1 719 bp。F2:5'-ATGAAAGAAAACTATGGCCG CTTGTCT-3'; R2:5'-AGTCTACATCACGGATTTG CGATTCTG-3',F2+R2扩增长度为640 bp。
1.3 其他试剂
1.3.1 生化试剂 Taq酶、buffer、dNTPs、DNA Mar k er(均为大连宝生物工程公司)。
1.3.2 样品保存液 商品化DNA保存液(北京康为世纪生物科技有限公司)。
1.3.3 核酸纯化试剂盒 微量DNA快速纯化试剂盒(VWI产品)。
1.4 检测样品
从某发病鸡场临床采集的鸡肝脏、脾脏、盲肠和泄殖腔粪便。
2.1 样品的采集
取发病鸡进行组织解剖,取病变肝脏、脾脏、盲肠、泄殖腔粪便各1 g左右,分别快速剪碎,置于10 mL DNA保存液,4 ℃ 保存。
2.2 样品 DNA 的提取
按微量DNA快速纯化试剂盒操作说明书进行,主要是取组织样品经蛋白酶K消化,置于DNA 结合柱,经离心冲洗,加洗脱液冲洗,收集纯化的DNA样品,以备下一步使用。
2.3 Nested-PCR
参考高正琴等[6]方法,第一次PCR反应用纯化的组织样品DNA作为模板,用F1及R1引物进行PCR反应,扩增理论设计长度为1 719 bp的DNA大片段;第二次PCR反应进一步取第一次PCR扩增产物作为模板,用F2及R2引物进行Nested-PCR反应,扩增理论设计长度为640 bp的小片段。
3.1 病鸡的临床表现
鸡场发病率为5%,病鸡表现精神沉郁,食欲减少,病初拉稀,有饮水欲,肛门周围污染粪便。腹部增大,鸡冠苍白,出现急性死亡现象。多数病鸡转为慢性,表现精神萎顿,可见鳞片状皮屑、逐渐消瘦、饲料消耗减低等。
3.2 剖检病理变化
病死鸡尸体脱水、消瘦,后部羽毛污染;肝被膜下或实质内有大小不等、数目不一的血泡肿,肝脏肿大、边沿钝圆、瘀血,有出血点和坏死点,肝质地硬化易碎,呈网格状碎块;脾脏肿大,有坏死斑点;胆囊肿大,色泽呈黄绿色,胆汁充盈、黏稠;心包积液,呈透明的橙黄色,心肌松软无力,心肌有黄色坏死灶;肾肿大褪色;脾脏极度肿大变圆,呈斑驳状外观;腺胃松弛无力,乳头偏平,肌胃和腺胃及空肠黏膜有不同程度出血、瘀血,直肠部位出血及卡他性肠炎。
3.3 PCR结果
本实验中的组织样品,及对照样品用Nested-PCR 检测后,可见到如下实验结果。
阳性对照样品,空肠弯曲菌(ATCC33560)经Nested-PCR检测后,第一次PCR和第二次PCR反应分别扩增出一条长度为1 719 bp和640 bp的特异性DNA片段,符合实验设计要求。阴性对照样品经Nested-PCR检测后未出现特异性DNA条带,说明实验结果成立。
病鸡组织样品:病鸡组织样品肝脏、脾脏、盲肠、泄殖腔粪便等四种组织样品经Nested-PCR检测后,第一次PCR和第二次PCR反应分别扩增出一条长度为1 719 bp和640bp的特异性DNA片段,符合实验设计要求(图1、2),说明病鸡存在空肠弯曲菌感染。
4.1 空肠弯曲菌是一种容易引起感染的疾病,通常由于饲养条件和管理方式存在不足,而导致鸡感染发病,尤其是内脏感染,引起鸡生产性能降低、发育迟钝、饲料报酬低,造成养鸡场的经济损失。过去的资料表明,空肠弯曲菌的发病率为1%~2%,本研究中发现,该病鸡场的发病率达到5%,病鸡肝脏、肾脏、脾脏等实质器官出现明显的出血、肿大等病理变化,导致养鸡场的经济损失较为严重,提示鸡空肠弯曲菌对鸡的致病性有可能加强,应引起重视。
4.2 传统的检测空肠弯曲菌的方法是通过细菌培养,再进行生化鉴定,需要一周以上的诊断时间,且细菌培养条件苛刻,对实验条件具有较高的要求。故传统的细菌培养鉴定方法只适用于条件较好的实验室进行,不适宜推广。本研究采用Nested-PCR 对临床采集的空肠弯曲菌感染鸡样品进行检测,检测的发病鸡样品经第一次PCR反应,均扩增了长度为1 719 bp的特异的DNA条带。进一步取第一次PCR反应产物最为模板,用Nested-PCR扩增了长度为640 bp的特异DNA条带,从而确保了该PCR诊断空肠弯曲菌感染的特异性和灵敏性。该PCR实验结果清晰,操作简便,于24小时内即可获得检测结果。建议该Nested-PCR方法推广使用。
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