益生菌的筛选及安全性研究进展

董秋月，陈檬燕，辛杨，秦雪艳，程卓，石陆娥

（杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036）

随着生活水平的提高，大家开始更多地关注健康，人们对食品的要求也不再仅限于满足最基本的生理需求。于是，像益生菌、益生元这类有益于身体健康的食品添加剂逐渐吸引了人们的眼球。虽然目前益生菌的多种益生性能已经被大家所认可，但是益生菌制品却没有得到充分的开发。这主要是因为益生菌的保藏不易，更重要的是益生菌的种类繁多。筛选出动物体内的不同益生菌，研究益生菌的生理生化特性，进行安全性鉴定是近年来微生物研究中重要的重要组成部分[1]。益生菌在促进人体健康和防止疾病中发挥着重要的作用，是未来功能食品发展的重要领域。

1 益生菌的来源、种类

益生菌来源主要是动物肠道正常生理性菌和非肠道菌。科学家已发现的益生菌大体上分成3大类，其中包括：（1）乳酸杆菌类（如嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、詹氏乳杆菌、拉曼乳杆菌、短乳杆菌、保加利亚乳杆菌等）；（2）双歧杆菌类（如长双歧杆菌、短双歧杆菌、卵形双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、青春双歧杆菌等）[2]；（3）革兰氏阳性球菌（如粪链球菌、乳球菌、中介链球菌等）。此外，还有一些酿酒酵母菌、布氏酵母菌、部分霉菌与非致病性大肠杆菌亦可归入益生菌的范畴。

2 益生菌的选择[3]

2.1 安全性要求

（1）人类用的益生菌要来自于人体；（2）分离来自于健康人的胃肠道；（3）不能产生某些疾病（如心内膜炎或胃肠道紊乱）；（4）没有可传递的抗生素基因。

2.2 功能性要求

（1）耐胆汁；（2）耐酸和耐胃液；（3）可黏附在胃肠道等上皮表面并且能够存活（定植和黏附力）；（4）刺激免疫系统，提高免疫力，并不引起某些炎症；（5）对病原菌有拮抗作用（抑菌作用），如幽门螺杆菌、沙门氏菌杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等；（6）有抗诱变和防癌功能。

2.3 加工性要求

（1）成本低廉且容易处理；（2）具有好的感官特性；（3）能够抗噬菌体；（4）在产品和储藏过程中能够保持稳定性；（5）在加工过程中能够保证稳定有效的活菌数。

3 益生菌的传统分类筛选方法

传统的分类鉴定方法通常指表型分类法，包含形态特征、生理生化反应、血清学反应等，方法原理都是基于微生物表面受体的特异性。

形态结构和培养特征试验：形态结构观察是指利用显微镜对被染色的微生物形状、大小、排列方式、细胞结构及染色特性进行镜下直接观察。不同微生物在相同的培养基中形成的菌落特征有很大的差异，而在一定的条件下，同一种微生物的培养特征具有一定的稳定性，因此可以区别不同微生物的一依据[4]。

细菌生理生化试验：包括含碳化合物利用、淀粉水解试验、糖或醇类发酵试验、过氧化氢测定等。

4 益生菌的敏感性和存活力

采用滤纸片抑菌圈法或牛津杯法可辨别不同种类益生菌对各种抗生素的敏感性，马艳等[5]进行了益生菌对抗生素的敏感性实验，结果表明：乳酸菌对盐酸林可霉素、庆大霉素敏感，而对丁胺卡那霉素不敏感；芽抱杆菌对庆大霉素敏感，对盐酸林可霉素不敏感，对丁胺卡那霉素中度敏感，视具体情况配伍使用；粪链球菌对庆大霉素敏感，而对盐酸林可霉素、丁胺卡那霉素不敏感；而3种菌的复合菌可以分别与以上3种抗生素混合使用。

有研究发现要获得所期望的治疗效果，益生菌的数量必须达到足够的数量。因此提高益生菌活菌数量己成为商业中的重点研究课题。日前，提高生菌存活力的方法有[6]：（1）选择耐酸和耐胆盐的菌株，有助于提高原生菌的生存能力；（2）选择合适的接种量；（3）利用二步发酵法，可以使产品中的益生菌数量比原来提高4倍～5倍；（4）微胶囊技术，以此来降低细胞的损伤或死亡；（5）抗性调整，有助于提高益生菌体对不同环境的耐受性；（6）添加微量营养物质如蛋白质、肽和氨基酸；（7）添加抗坏血酸（作为除氧剂）；（8）选择合适的包装容器；（9）利用超声波降解乳酸菌释放a-半乳糖酶。

5 益生菌功能性的研究进展

5.1 缓解腹泻和调节肠道菌群的功能

根据研究表明，益生菌能够预防和改善腹泻，由于饮食习惯或食用抗生素均会打破肠道菌群的平衡，从而会导致腹泻，补充益生菌能够增加肠道蠕动，防止细菌过度生长，调节肠道菌群及恢复肠道正常的pH值，从而提高肠道机能，缓解腹泻症状[7]。具有改善胃肠道功能的益生菌必须具备某种特性才能在微环境中保持优势，如钻附、竞争排斥、占位和产生抑制物等。以双岐杆菌和乳酸杆菌为主的专性厌氧菌与黏膜上皮表面特异性受体相结合形成组分相当同定的菌膜结构和生物屏障，构成肠道定植力，可有效抵御过路菌对机体的侵袭。目前已证实对胃肠炎具有预防与治疗功效的专利菌株包括LGG，L.rhumnosus 19070-2，L.reuteri DSM 12246，Bifidobuterium Bl）-12 和 L.purucasei ST11等[8-9]。

5.2 降低血脂胆固醇水平的功能

针对益生菌降低血脂胆固醇水平的机制，国内外学者进行了广泛的研究，目前产生了多种不同的假说，包括（1）胆盐的脱结合；（2）胆固醇掺入细胞膜（胆固醇掺入或附着在细胞上将有可能减少胆固醇由肠道进入血液中）；（3）益生菌对胆固醇的吸收；（4）菌体对胆固醇的吸附；（5）菌体对胆固醇的转化（益生菌产生的胆固醇还原酶的作用将胆固醇转化为粪烯醇排出体外从而起到了降低血液中胆固醇含最的作用）等。

目前已申报具有降低血脂脂胆固醇功能的专利菌株众多，包括L.ucidophilus RP32}L.uci dophilus ATCC 4962}L.delbrueckii subsp.bulgaricus ATCC 33409 L.plunturum 299V等[10]。

5.3 调节血压的功能

根据研究表明益生菌的降血压作用在于其能够代谢产生蛋白酶，从而降解蛋白质，产生ACE活性抑制肽。益生菌代谢产生的蛋白酶，包括肽链内切酶以及氨基肽酶，在这些酶系的连续作用下，限制性水解蛋白，主要是酪蛋白，产生分子大小以及作用各有差异的生物活性肽段，其中包括已经发现的具有抑制ACE活性的小肽，如从啤酒酵母和瑞士乳杆菌中分离的三肽物质（Val-Pro-Pro或Ile-Pro-Pro），具有抑制血管紧张素转移酶I活性的作用[11-12]。

此外Saivacla等[13]发现L.casei细胞壁成分对自发性高压血大鼠（SHR）和和肾性高血压大鼠（RHR）具有明显降压作用，这种降压作用呈现出一定的剂量效应。以上研究说明益生菌的菌体或其代谢产物都可能具有调节血压的效果。

5.4 具有营养功能

目前，有营养特性的益生菌主要是芽孢杆菌、其次是双歧杆菌、乳酸杆菌等[14]。益生菌（如芽孢杆菌）可产生多种挥发性酸，包括乙酸、丙酸、丁酸等，这些有机酸能够降低动物肠道的pH，抑制病原菌的生长，为乳酸菌的生长提供条件。也有一些益生菌如（双歧杆菌和乳酸杆菌等）可产生多种机体所需要的维生素，包括 VB1，VB2，VB6，VB12以及烟酸和叶酸等，使机体保持正常的生理活动。此外部分益生菌可代谢产生人体所需的必需氨基酸、短链脂肪酸等，均对人体骨骼成长和心脏健康有重要作用。

5.5 刺激免疫系统，提高免疫功能

益生菌对机体免疫系统的影响，包括体液免疫调节作用，细胞免疫调节作用及非特异性免疫调节作用。

实验证实，双歧杆菌在胃肠道中能够刺激B淋巴细胞活化增殖和分泌抗体，来发挥体液免疫功能。Gately等给小鼠喂短双歧杆菌发酵乳，发现小鼠的肠粘膜下淋巴结增生，在机体外实验中，短双歧杆菌能够促进小肠粘膜下淋巴结细胞增殖。经检验发现，这些淋巴细胞主要是B淋巴细胞[15]。

目前人类研究表明，益生菌对宿主细胞免疫系统具有正面作用如增强抵抗力。一些益生菌已被证明是使Th1/Th2的平衡倾向于Th1细胞，这可以解释它们对过敏和抵抗力的影响，缺点可能是益生菌可以刺激Th1细胞介导的疾病（如自身免疫疾病）[16]。

此外双歧杆菌作为机体消化道内的优势菌群，能够明显激活作为机体天然抵抗力的一个重要组成部分——吞噬细胞的活性，进而增强机体的非特异性免疫功能。Guarino等研究发现，健康人口服两双歧杆菌，可以提高粒细胞和单核白血球的吞噬活性。

益生菌对免疫抵抗力，接种疫苗的反应，过敏性湿疹，和溃疡性结肠炎的影响公布的数据表明，某些益生菌可能是有效的。然而，需要更多的研究来证实这一点。

5.6 抗突变抗癌功能

人们发现，以大鼠和小鼠作为模型，一些双歧杆菌和乳杆菌在体外具有抗癌和抗肿瘤作用[17]。

人体实验表明，益生菌可以通过结合、阻断或移除来抑制致癌物和前致癌物。还可以对前致癌物转化为致癌物的细菌及转化酶的活力进行抑制。说的简单点，益生菌可以吸附致癌物和对致癌物质进行加工或转移，减弱它们的毒性。益生菌能够帮助身体远离有害细菌和有害的酶，它们就没有加工致癌物的机会了。最典型的例子就是益生菌能降低粪便酶的活力，有效预防结肠癌。第二，益生菌能酸化肠道，调节肠道菌群，从而减少有害菌的数量和改变胆汁溶解性。使胆汁减少向致癌物二次胆汁酸的转化。第三，益生菌能促进肠道蠕动，加快对粪便中有害的致癌物的排出。

除以上生理功能外益生菌还具有其他功能，包括：①缓解不耐乳糖症状；②预防生殖系统感染；③缓解关节炎；④促进消化作用；⑤延缓衰老（抗氧化作用）；⑥抑菌作用。

6 益生菌的潜在危害性研究

益生菌的安全性是非常重要的。通过研究益生菌在胃肠道的存活、移位、定居和代谢，可用来评价食用益生菌的正面作用和负面作用。益生菌所带来的益处很多，但也存在着一些潜在危害，包括：①可能产生条件性感染（如心内膜炎和败血症等局部或全身性感染）；②可能产生炎症（超敏反应）；③可能产生具有潜在危害性代谢产物和对机体有影响的代谢酶（如D型乳酸、氨基脱羧酶和硝基还原酶等）④可能会转移抗生素基因等[18-19]。

7 分子水平上益生菌研究进展

7.1 菌株的分离与鉴定

应用分子生物学的方法，能够根据益生菌基因组DNA序列的特异性，进行群间、属间、种间、亚种间、乃至菌株之间的鉴定，帮助从复杂的培养物中间分离菌株[20]。

鉴定益生菌的分了生物学方法主要包括PCR技术、基因组探针技术、基因组指纹技术（如RFLPs技术、RAPD技术和AFLPs技术））等[21]。PCR技术相对简单快速，指利用专一性的引物，分析复杂菌群的菌种分布情况检测染色体上是否存在致病因子的基因，帮助进行菌株鉴定。探针技术与生物芯片技术结合，能够从复杂微生物环境中快速检出并追踪感兴趣的菌株，探针技术使用的探针包括核糖体寡核苷酸探针（一般是16S rRNA）、全染色体探针、根据基因组的特殊的序列设计的DNA片段、质粒DNA探针等。基因组指纹技术利用DNA片段长度的多态性，能够区分不同的菌株，帮助分析多样的、动态的微生物菌群[22-23]。

7.2 益生菌基因遗传修饰

目前基因工程技术在益生菌研究方面得到了广泛的应用，包括：构建能合成有用的特殊营养成分的益生菌菌株、构建能产生动物生理性缺乏的物质的益生菌株、利用基因工程技术生产抗耐性菌株以及提高定植和黏附力益生菌等[24]。

吕道俊等采用PCR方法扩增，对益生芽抱杆菌进行遗传改造，得到了地衣芽抱杆菌天门冬氨酸激酶基因，为研制既有益生功能，又可以在体内直接产生供机体需要的氨基酸等营养物质的多功能基因工程益生菌提供了基础。此外利用益生菌作为体内生物反应器，可以表达外源基因主要包括酶基因和抗病基因，对促进消化的外源激素、酶基因的克隆和表达的报道也比较多。可见益生菌作为基因工程受体菌的应用前景十分广阔。

8 展望

随着益生菌产品的不断壮大，益生菌的研究工作还需要进一步深入，亟待研究的领域总结如下：①通过直接对人进行口服益生菌产品等试验，确定益生菌的生理学功能、作用机理及其产生的影响程度。②益生菌的功能评价，特别是对免疫系统、癌症和肠道微生态的调节功能。③评价益生菌对肠道微生物的数量和活性的影响，基因重组技术在这一领域有较大的应用潜能。④确立载体对益生菌的影响。⑤提高益生菌分类的可靠性并使之易于分类，提高菌株的性能和活性。

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