牡蛎水解蛋白制备及脱腥技术研究

许庆陵，周勇强，战宇，顾彩琴，曾庆祝，*

（1.广州大学分析测试中心，广东 广州 510006；2.广州大学化学化工学院，广东 广州 510006）

牡蛎，肉味鲜美，是一种高营养的水产品，有“海中牛奶”之称，是我国四大养殖贝类之一，在广东、广西、福建、浙江、台湾等沿海地区都进行大量人工养殖，其大多数作为生鲜食品消费，但牡蛎出水后会很快死亡，容易被微生物污染，且不耐藏，不耐冻[1]。目前，国内牡蛎以鲜食和制成干肉制品或罐头制品为主，少量加工成蚝油或其它调味品。随着牡蛎养殖业的快速发展，牡蛎已出现供过于求和价格下跌的趋势，开发牡蛎加工利用的新途径对促进牡蛎养殖业进一步发展具有十分重要意义[2]。

目前，针对牡蛎的研究开发热点有，从牡蛎中提取抗氧化活性肽和抗肿瘤活性肽[3-4]、采用胰蛋白酶、胃蛋白酶或木瓜蛋白酶制备牡蛎水解蛋白，但水解效果不甚理想[5]，采用Alcalase碱性蛋白酶制备牡蛎水解蛋白的研究报道相对较少。刚捕获的鱼贝类腥臭味轻微，但随着鲜度下降，腥臭味逐渐增强。牡蛎肉经过酶解制得水解蛋白之后，呈现出牡蛎特殊香气和味道，主要呈味成分是酶解产生的氨基酸、小分子肽类，以及醛、酮、酸和酚类等[6]。同时，水解液中也有一定腥味，这种腥味给牡蛎水解蛋白的风味带来了负面影响，所以有必要对牡蛎水解蛋白进行脱腥，使其具有更加纯正的牡蛎风味，其中，美拉德反应是一种脱腥的可选方法[7-8]。针对牡蛎酶解蛋白液脱腥技术的研究起步较晚，大多是在2009年才开始研究[7]，有关研究报道也不多。为此，本实验采用Alcalase碱性蛋白酶道也不多。为此，本实验采用Alcalase碱性蛋白酶对牡蛎进行水解制备牡蛎水解蛋白，通过正交试验优化其水解条件，并对牡蛎水解蛋白液的腥味脱去技术进行研究和优化，丰富和完善牡蛎水解蛋白的制备技术，为牡蛎肉的深加工和综合利用提供依据，提高牡蛎的经济和社会价值。

1 材料和方法

1.1 材料及试剂

新鲜牡蛎：购自超市；Alcalase碱性蛋白酶：丹麦诺维信公司；食品级活性炭：市售；葡萄糖：市售；甲醛、盐酸、氢氧化钠等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

数显恒温水浴振荡器THZ-82：江苏省金坛市宏华仪器厂；DHS-20型精密酸度计：上海雷磁仪器厂；紫外/可见分光光度计UV－2100：北京瑞利仪器有限公司；自动凯氏定氮仪S5：德国Labor-Technik；六联同步电动搅拌机JJ-6：江苏金坛市华欧仪器厂；冷冻离心机J-6M：美国BECKMAN；旋转蒸发仪Hei-VAP，德国Heidolph；微型实验室喷雾干燥仪YC-015：上海雅程仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牡蛎水解蛋白制备

原料解冻→捣碎→按适当料液比加水→牡蛎原料浆液→调节酸碱度→加入蛋白酶→酶解→灭酶活→离心分离→真空浓缩。

1.3.2 测定方法

水解度（DH%）测定：甲醛滴定法[10]。

1.3.3 脱腥工艺

取一定量牡蛎水解蛋白液→加入脱腥剂（活性炭/葡萄糖）→恒温脱腥→离心（4000 r/min，10 min）→过滤→上清液→感官评定。

1.3.4 感官评定方法

腥味感官评定标准见表1及表2。

表1 活性炭脱腥评分标准Table 1 Sensory evaluation tandards of deodorization by activecarbon

表2 美拉德反应产物风味评分标准Table 2 Sensory evaluation tandards of flavor by Mailard reaction

2 结果与讨论

2.1 牡蛎水解蛋白制备工艺条件

2.1.1 酶添加量的确定

取5份牡蛎原料浆液，分别加入酶活量500×16.67 ×10-6、600 ×16.67 ×10-6、700 ×16.67 ×10-6、800 ×16.67×10-6、900 ×16.67×10-6kat/L 的 Alcalase碱性蛋白酶，于60℃水浴锅中恒温水解2.5 h（其间保持pH恒定），然后100℃水浴灭酶10 min，再经5000 r/min离心20 min，取上清液测水解度，结果见图1。

图1 酶加量对水解度的影响Fig.1 Effect of additive mount of enzyme on the DH

图1表明，酶加量对牡蛎水解度的影响较大，随着酶加量从 500×16.67×10-6kat/L～900×16.67×10-6kat/L的增加，牡蛎水解度由35.9%到41.28%增大。当酶加量增至 800×16.67×10-6kat/L（即：13.34 mkat/L）时，其水解度的增长趋势平缓。从理论上不难解释，随着酶量的增加，酶与底物蛋白质的接触几率增加，酶对底物蛋白质的解裂作用增强，因此，水解度也逐渐增加。基于成本因素的考虑，选用13.34 mkat/L为适宜酶加量。

2.1.2 水解时间的确定

取5份牡蛎原料浆液，分别加入13.34 mkat/L Alcalase碱性蛋白酶，在60℃下分别恒温水解1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h（其间保持 pH 恒 1.5、2.0、2.5、3.0 h（其间保持pH恒定），然后100℃水浴灭酶10 min，再经5000 r/min离心20 min，取上清液测水解度，结果见图2。

图2 水解时间对水解度的影响Fig.2 Effect ofhydrolysis time on the DH

图2表明，随着水解时间延长，水解度逐渐增加，当水解时间达到2.5 h时，水解度达到最高，随后水解度基本保持恒定，这说明酶解时间达2.5 h时，底物蛋白质已基本被水解，再延长酶解时间，水解度也不再增加。基于经济效率因素，酶解时间初为2.5 h。

2.1.3 水解温度的确定

取5份牡蛎原料浆液，分别加入13.34 mkat/L Alcalase碱性蛋白酶，分别在 40、50、60、70、80 ℃下恒温水解2.5h（其间保持pH恒定），100℃水浴灭酶10min，再经5000 r/min离心20 min，取上清液测水解度，结果见图3。

图3 温度对水解度的影响Fig.3 Effect ofhydrolysis temperature on the DH

图3表明，在40℃～60℃时，随着温度的升高，水解度增加，60℃时水解度达到最高，超过60℃时水解度随温度的升高反而下降，这可能是由于随着温度的升高，Alcalase碱性蛋白酶的活性有所降低，因此水解效率降低。因此，酶解温度初定60℃为宜。

2.1.4 酶解pH的确定

取5份牡蛎原料浆液，分别用0.05 mol/L NaOH溶液或 HCl溶液调 pH 为 7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，分别加入13.34 mkat/L的Alcalase碱性蛋白酶，在60℃下酶解，其间分别保持各自恒定的pH，恒温水解2.5 h，然后100℃水浴灭酶10 min，再5000 r/min下离心20 min，取上清液测水解度，结果见图4。可知，pH对水解度的影响较大，当pH为8.0时水解度达最大，继续增大pH会影响酶活力，导致水解度反而下降。所以，酶解pH初选8.0。

2.1.5 酶解工艺条件优化

图2 pH对水解度的影响Fig.2 Effect pH on the DH

为优化牡蛎酶解工艺条件，在单因素试验基础上，采用L9（34）正交试验设计方案，选择酶加量、温度、时间和pH 4个因素，每个元素选3个水平，以水解度为指标进行酶解工艺条件优化。因素及水平安排见表3，正交试验方案及结果见表4。

表3 正交试验L9（34）因素水平表Table 3 Factor and levels of L9（34）

表4 正交试验方案及结果Table 4 Orthogonal test results of hydrolysis

由正交试验结果表4可知，影响水解度的主次因素为A>B>D>C，即酶加量>水解时间>pH>温度。再对获得的两个实验优方案为A2B2C1D2和A2B3C1D2进行对比试验发现，A2B2C1D2方案的水解度为最高39.25%。因此，确定酶解的最优方案为A2B3C1D2，即：酶加量13.34 mkat/L，水解时间 2.5 h，pH8.0，温度 65℃。

2.2 水解蛋白脱腥实验

2.2.1 活性炭脱腥

2.2.1.1 活性炭使用量的确定

取10 mL水解蛋白液5份，按1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%比例分别加入活性炭（试验组号依次为A1、A2、A3、A4、A5），充分搅拌，在 45 ℃恒温水浴中保持80 min，再经4000 r/min离心10 min，上清液经过滤后按照表1的标准进行感官评分，评分结果见表5中A1～A5所示。

表5 活性炭使用条件对脱腥效果的影响Table 5 Effect of operation condition of active carbon on deodourization

由表5实验A1～A5可知，随着活性炭使用添加量的增加，其颜色、澄清度及脱腥效果都是越来越好。当活性炭添加量增至2.5%时，综合得分及状态与活性炭添加量增至3.0%时一样，得分均为13分，此时，牡蛎酶解液的颜色为淡黄色，溶液澄清，腥味很小。因此，确定活性炭添加量为2.5%较为经济适宜。

2.2.1.2 脱腥时间的确定

取10 mL水解蛋白液5份，各加入2.5%活性炭，充分搅拌，在45℃水浴中下分别保持20、40、60、80、100 min（试验组号依次为 B1、B2、B3、B4、B5），再经4000 r/min离心10 min，上清液经过滤后按照表1的标准进行感官评分，评分结果见表5中B1～B5所示，可知，随着脱腥时间的增加，牡蛎酶解液的感官评分越来越高，说明其脱腥效果越来越好。脱腥时间的达80 min时，脱腥效果已达到最佳。因此，确定80 min为宜，此条件下，牡蛎酶解液的颜色为淡黄色，溶液澄清透明，无腥味。

2.2.1.3 最适脱腥温度的确定

取水解液5份，每份10 mL，加入2.5%活性炭，充分搅拌，分别置于 25、35、45、55、65 ℃（试验组号依次为 C1、C2、C3、C4、C5）水浴中保持 80 min，再经4000 r/min离心10 min，上清液经过滤后按照表1的标准进行感官评分，评分结果见表5中C1～C5所示，可知，从25℃到45℃，感官评分随水温递增，说明脱腥效果渐好。当脱腥温度在55℃以上时，酶解液的颜色反而加深，澄清和腥味几乎没有变化，因此，确定适宜脱腥温度为45℃。

2.2.2 美拉德反应脱腥

2.2.2.1 葡萄糖添加量的确定

取10mL水解液5份，分别加入1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%葡萄糖（试验组号依次为 A1、A2、A3、A4、A5），搅拌至充分混匀，在100℃水浴中保持30 min，再经4000 r/min离心10 min，上清液经过滤后按照表2的标准进行感官评分，评分结果见表6中A1～A5所示。

表6 美拉德反应条件对脱腥效果的影响Table 6 Effect of condition of Maillard reaction on deodourization

由表6可知，在添加量为1.0%～3.0%时，酶解液的感官风味总分随添加量增加，说明其感官风味越来越好；而当葡萄糖添加量超过3.0%以后，酶解液的香味浓郁，没有腥味，苦味也几乎没有，但是，酶解液特有的风味有所减弱，而且鲜味受到一定抑制。因此，美拉德反应所用还原糖（葡萄糖）的适宜添加量为3.0%。

2.2.2.2 美拉德脱腥时间的确定

取10 mL水解液5份，加入3.0%葡萄糖，充分搅拌，在 100 ℃水浴中分别保持 10、20、30、40、50 min（试验组号依次为 B1、B2、B3、B4、B5），再经 4000 r/min 离心10 min，上清液经过滤后按照表2的标准进行感官评分，评分结果见表6中B1-B5所示，可知，当反应时间达到30 min时，其感官风味评定分数升至最高，感觉无腥味及无苦味；当反应时间在40 min以上时，其鲜味反而因时间的延长而受到抑制。因此，确定美拉德反应还原糖（葡萄糖）的适宜反应时间为30 min，此时，酶解液具有糖香味，无腥味，鲜味浓郁，无苦味。

2.2.2.3 美拉德反应温度的确定

取10 mL水解液5份，加入3.0%葡萄糖，充分搅拌，分别放置在 60、70、80、90、100℃（试验组号依次为 C1、C2、C3、C4、C5）水浴中恒温保持 30 min，再经4000 r/min离心10 min，上清液经过滤后按照表2的标准进行感官评分，评分结果见表6中C1～C5所示，可知，酶解液的感官风味评定总分随反应温度升高而递增，说明温度对其风味有影响。随着温度的升高，美拉德反应程度越深，产生的香味也越突出，在温度为100℃下的美拉德反应所产生的感官风味达到最佳。因此，确定美拉德反应的适宜温度为100℃，此时，酶解液具有浓郁香味，无腥味，鲜味浓郁，且无苦味。

3 结论

1）采用Alcalase碱性蛋白酶制备牡蛎水解蛋白的最适工艺条件为：酶用量13.34 mkat/L，水解温度65℃，pH 8.0，水解时间2.5 h，在此条件下牡蛎蛋白质的水解度高达40.38%。

2）通过活性炭及美拉德反应对牡蛎水解蛋白液脱腥技术试验发现：活性炭吸附及美拉德反应两种方法对酶解液的脱腥均能产生一定的效果；活性炭脱腥的最适条件是活性炭使用量2.5%、脱腥时间80 min、脱腥温度45℃；美拉德反应脱腥的最适条件是葡萄糖添加量3.0%、脱腥时间30 min、脱腥温度100℃；综合比较两者的脱腥效果，美拉德反应为较好的脱腥方法。

[1]陶晶,杨瑞金,张文斌,等.即食牡蛎软罐头的研制[J].食品研究与开发,2008,29（4)：94-98

[2]吴文龙,杨志娟.双酶法水解牡蛎肉工艺条件的研究[J].食品科技,2005(11):32-34

[3]王春波,兰晓明,王洪江,等.牡蛎软体中抗菌蛋白的制备及活性研究[J].海洋湖沼,2010,41(1):33-38

[4]陈艳辉,李超柱,黎丹戎,等.动物蛋白酶解制备广西产牡蛎肉抗肿瘤活性肽的实验研究[J].食品工业科技,2010,31(8):167-169

[5]谭雯文,周延华,梁海秋,等.牡蛎蛋白的纯化及酶解条件的研究[J].现代食品科技,2006,22(2):79-82

[6]汪何雅,杨瑞金,王璋.牡蛎的营养成分及蛋白质的酶法水解[J].水产学报,2003,27(2):163-168

[7]张洁,董士远,郭晓伟.美拉德反应用于牡蛎酶解液脱腥的研究[J].食品工业科技,2009,30(11):215-217

[8]叶盛权,吴晖,赖富饶,等.牡蛎酶解过程的成分变化及脱腥初步研究[J].现代食品科技,2009,25(3):262-265