水产品中四环素类药物残留检测方法研究

李红梅，邹 洁，杨建涛，李洁莉，尤继明，徐德宁，韩 华，杨抗震

（1.江苏省宝应县产品质量监督检验所，江苏 宝应225800；2.国家有机食品质量监督检验中心，江苏 宝应225800；3.江苏省产品质量监督检验研究院，江苏 南京210029；4.河南农业大学 林学院环境系，河南 郑州450002）

1 引言

四环素类抗生素（tetracycline antibiotics）是由放线菌产生的一类广谱抗生素，由于实用性高且价格低廉，在畜禽养殖和饲料添加剂等方面得到了广泛的应用。近年来，我国的养殖业发展步伐加快，水产业发展迅速，水产品总量连续几年居世界第一，2005年产量已超过4 000万t[1～4]。随着集约化水产业的发展，鱼类疾病也越来越复杂，鱼药和抗生素饲料添加剂的使用量也日渐增加，由于滥用药物，导致了渔药大量残留，严重影响了水产品的质量安全。因此，为了保障水产品质量安全，消除贸易壁垒，就必须加快对药物残留分析方法的研究。为此本文对水产品中四环素类药物残留的检测方法进行了分析研究。

目前，四环素类抗生素残留检测方法很多，大致分为3类，一是生物测定法[5～7]，包括微生物测定法（microbiological assay）、放射受体测定法（redio receptor assay）等；二是仪器分析法[8～20]，包括波谱分析、紫外分析，荧光分析，高效液相色谱分析，气相色谱分析，液质联用分析等；三是免疫分析法[21，22]，包括酶联免疫测定法（EIA，ELISA）、胶体金免疫层析法等。

2 微生物测定法

微生物测定法是目前公认而又广泛应用于测定抗生素的测定方法，也是目前我国药典中引用的标准方法，主要有纸片扩散法、微生物管碟法、E～test法等。

2.1 纸片扩散法

纸片扩散法（paper disc，简称PD法），是依据抗生素能够抑制微生物的生长繁殖这一特性而设计的[5，6]。其原理就是将样品提取液加一定量在纸片上，并贴在菌生长的培养基上，一段时间后测其抑菌圈的大小。如果水产品中存在抗生素残留，则其样品提取液可以抑制微生物的生长；反之则微生物的生长不会受到抑制，而水产品中抗生素残留的多少则可以根据对微生物的抑制程度来判断。

2.2 管碟法

管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法[1]，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。其基本原理同PD法，利用抗生素在摊布特定实验菌的固体培养基内呈球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了实验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈线性关系，比较标准品与供试品两者对接种的实验菌产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价[7]。但整个试验过程中影响结果的因素很多，任何一个环节的操作不当就会造成很大误差，导致整组试验失败。

微生物法虽然原理及操作简单，费用低，一般实验室都能操作，但是测定所花的时间太长，灵敏度低，结果误差较大。在测定时样品需在pH值为4.5的条件下培育3～4h，而有些抗生素，例如土霉素、四环素在酸性条件下易发生差向异构化，形成异构体难于分离，而其抗菌活性减弱或完全消失，限制了此方法的使用。

3 仪器分析法

目前，水产品中四环素类药物残留的常用的仪器检测方法主要有液相色谱法（HPLC）及液相色谱～串联质谱法（LC～MS/MS）。

3.1 液相色谱分析法

高效液相色谱更适宜于分离、分析高沸点、热稳定性差、有生理活性及相对分子量比较大的物质，因而广泛应用于药物残留的分析检测。

袁冬梅等[12]采用乙酸乙酯（1mol/L）＋乙酸镁（0.005mol/L）＋EDTA（0.001mol/L）的混合液提取样品，并用此混合液和甲醇以72：28（V/V）作为流动相分离土霉素、金霉素和四环素，最低检出限分别为0.013mg/g、0.016mg/g、0.014mg/g。

徐传梅[13]等采用CaCl2衍生化，样品经5%HClO4除蛋白后，离心过滤。采用 Waters XTerra RP18（5μm，4.6×150mm）色谱柱，以 V（甲醇）∶V（CaCl2缓冲液）＝30∶70（pH 值为6.6）为流动相，等度洗脱，流速0.8mL/min，柱温25℃。经CaCl2缓冲液衍生化，在激发波长（Zx）350nm和发射波长（Zm）520nm处检测土霉素、四环素和金霉素的残留量，土霉素的最小检测限为1.48ng/mL，四环素为1.20ng/mL，金霉素为2.32ng/mL。

黄志勇[14]等人采用4%高氯酸溶液提取样品中的残留抗生素，经浓缩处理，以乙腈和0.01mol/L NaH2PO4（18∶82，v/v）为流动相，流速1mL/min，3种抗生素组分峰能与杂质峰完全分开，检测波长为355mm，最低检出限为0.08mg/g。

北京化工大学的王覃[15]等人以醋酸铵～醋酸/水缓冲液和乙腈作为流动相，通过二元梯度洗脱，使海产品中四环素类抗生素得到了较好的分离，最低检出限在15～32mg/kg。

浙江任一平[16]等人用高效液相色色谱对动物性食品中土霉素和四环素进行测定，样品经含乙二胺四乙酸二钠的丁二酸钠缓冲液除蛋白后，由SPE～C18小柱提纯净化，经ODS～C18柱分离后，用8%氢氧化锆溶液柱后衍生，与锆离子的螯合物在激发波长（EX）：406nm 和发射波长（Em）：515nm 处检测，土霉素和四环素的最低检出限为3mg/L和4mg/L。

杨挺[17]等人建立了一种高效液相色谱法测定水产品中土霉素、四环素、去甲基金霉素、金霉素、脱氧土霉素的分析方法。样品用5.0%高氯酸溶液提取，上清液用Oasis HLB固相萃取柱净化，用紫外检测器于355nm测定。土霉素、四环素、去甲基金霉素检测限为0.01mg/kg，金霉素、脱氧土霉素检出限为0.02mg/kg。

从上面高效液相色谱检测方法来看，样品前处理多采用高氯酸等强酸或者MCI缓冲液提取，经固相萃取柱（C18或者HLB）净化后，仪器柱后衍生检测[2]。四环素类抗生素在酸性和碱性条件下均不稳定，四环素类药物中含有许多羟基、烯醇羟基及羰基，在中性条件下能与多种金属离子形成不溶性螯合物，仪器检测时候会出现几个峰，通过保留时间不易对结果进行判断，容易出现假阳性；而且缓冲溶液配制较为复杂，样品要经过固相萃取净化，前处理比较复杂，而且利用复杂的缓冲盐对仪器柱子的寿命有很大的影响，加上仪器分析技术的局限，难以适应大量复杂样品和现场快速检测的需要。

3.2 液质联用分析法

近年来，随着液质的普遍应用，由于其更加可靠，定量更加灵敏准确，能够去除假阳性干扰，特异性强，液质联用（LC～MS/MS）技术愈来愈多的应用于兽药残留的确证检测。

刘艳萍[18]等人用高效液相色谱～串联质谱法测定水产品中的4种四环素类药物残留量，以MTC缓冲液提取水产品中的四环素类残留物，经HLB固相萃取柱净化，采用LC～MS/MS选择反应监测（SRM）正离子模式测定，可一次对水产品中的四环素、土霉素、金霉素和强力霉素进行定性和定量。4种物质最低检出限均可达到2.0μg/kg。

洪武兴[19]等人用液质联用法检测水产品中四环素类残留，样品利用乙酸乙腈提取，氮气吹干，残渣用乙腈水溶解后，加入正己烷去除脂肪等杂质，取乙腈水相过0.45μm滤膜上机检测，采用子离子定量，四环素类药物的检测限均可达到20μg/kg。

林荆[20]等人用超高效液相色谱～串联质谱（UPLC～MS/MS）法测定水产品中6种四环素。样品粉碎后，用0.01mol/L Na2EDTA～Mcllvaine磷酸盐缓冲溶液提取，样液过滤后正己烷除脂，经Oasis HLB固相萃取柱净化，甲醇洗脱，氮气吹干缓冲液定容后，用反相液相色谱分离，电喷雾正离子模式离子化，用多反应监测模式（MRM）监测，三重四级杆质谱测定，外标法定量。该法对四环素类药物在5.0～50.0μg/kg范围内呈线性关系，相关系数r在0.996 9～0.999 9之间，在5.0、10.0、25.0、50.0μg/kg添加水平，回收率为61%～97%，相对标准偏差（RSD）为1.3%～5.7%，其检出限达2.5μg/kg。

液相色谱～串联质谱仪法测定水产品中四环素类药物残留，由于以子离子和母离子定性和定量，消除了假阳性，而且样品前处理比液相色谱简单，操作简便，稳定性好，选择性好，灵敏度高，检出限低，能够达到欧盟和日本等国家对进口水产品最高残留量的要求。

液质联用法的缺点就是仪器比较昂贵，对人员要求比较高，技术复杂，使用起来费用比较高，普遍性较差，但是随着社会的发展，利用液质联用法检测兽药残留是将是未来的发展趋势。

4 免疫分析法

4.1 酶联免疫法

酶联免疫吸附剂测定法，简称酶联免疫法，或者ELISA法[21]。它的中心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。酶联免疫试剂盒是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分去除。自从Engvall和Perlman（1971）首次报道建立ELISA（酶联免疫吸附试验，酶联免疫试剂盒）（Enzyme～Linked ImmunosorbentAssays，ELISA（酶联免疫吸附试验，酶联免疫试剂盒）以来，由于ELISA（酶联免疫吸附试验，酶联免疫试剂盒）具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用。

四环素类药物残留检测试剂盒能在短时间内进行大批量样品的筛选，又不需要复杂昂贵的大型仪器，具有特异性强、灵敏度高、样品预处理简单等优点。我国农业部1025号公告～20～2008中动物性食品中四环素类药物残留检测采用的是酶联免疫吸附法。

4.2 胶体金免疫层析法

胶体金免疫层析法即时检验技术（或称“侧流免疫层析技术”和“免疫胶体金技术”等）是20世纪90年代以来在单克隆抗体技术、免疫层析技术及胶体金显色技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术。近年来发展迅速，目前已经在农业、畜牧业、环境检测、尤其是在家庭自检领域得到了广泛应用。

四环素类药物为广谱抑菌剂，高浓度时具杀菌作用。其作用机制在于药物能特异性地与细菌核糖体30S亚基的A位置结合，阻止氨基酰～tRNA在该位上的联结，从而抑制肽链的增长和影响细菌蛋白质的合成。

檀尊社[22]等人采用免疫竞争法，将抗四环素单克隆抗体～胶体金复合物包被在胶体金结合垫上，并将人工合成的四环素抗原包被在硝酸纤维素薄膜表面作为检测线（线），其残留药物与待测样品中四环素竞争结合胶体金标记的四环素单克隆抗体，最终能以颜色直观显示检测结果。检测水产品试样时，试剂灵敏度最低值可达100ng/mL，仅需5～10min，与金霉素、土霉素、强力霉素等四环素族抗生素有很强的交叉反应，故可同时检测四环素族中几种主要抗生素，而与沙丁胺醇、莱克多巴胺等其他兽药无交叉反应。操作方便，仅需配备小型离心机，检测成本低廉。

免疫方法能够在短时间内进行大批量样品的筛选，又不需要复杂昂贵的大型仪器，具有特异性强、灵敏度高、样品预处理简单等优点。但是对于药残检测试剂盒的研发相对迟缓，免疫法对实验室温度、光线、使用溶剂要求较高，而且试剂盒使用起来比较昂贵，限制了其普遍应用。

5 问题和展望

微生物法是最早用于四环素类药物残留检测的方法之一。微生物法测定四环素类抗生素，在实验中发现抑菌圈不是很规则，直径大小不一致，由此计算并绘制出的浓度曲线不准确，导致最终得出的样液测定结果不准确，所以该种方法只能用于定性试验。

液相色谱法灵敏度能够达到要求，是现阶段普遍采用的方法之一，但是前处理比较复杂，用的试剂都是有机试剂，容易污染环境，对人体造成伤害，而且四环素类药物在酸性和碱性条件下容易发生异构化，在仪器上检测容易出现假阳性。液质联用法前处理比较简单，耗时少，灵敏度高，检出限低，满足检测要求，是未来的发展趋势。

酶联免疫试剂盒的研制在我国还是比较落后的，随着技术的提高，酶联免疫试剂盒测定药物残留能够大大提高检测效率和满足多样品的同时检测。随着方法的不断改进、材料的不断更新，使其更为简便实用，因此标准化免疫法能够成为药物残留的快速检测方法。

6 结语

水产品中四环素类残留是涉及人类健康的问题，应加强检测工作，提高检测效率，降低检测成本，并努力研究发展一些简单、快速和便携化的筛选多残留分析技术，普及广大企业的出厂检验，如试剂盒检测；发展高效、高灵敏的联用技术和多残留组分确证技术，如LC～MS/MS；实现分析过程自动化或智能化，以提高分析效率、降低成本，保证消费者的健康。

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