点柄粘盖牛肝菌粗多糖体外抗氧化活性的研究*

史振霞，吴智艳

（廊坊师范学院生命科学学院，河北 廊坊 065000）

点柄粘盖牛肝菌（Suillus granulatus）又名黄花松茸、栗壳牛肝菌，是真菌门（Enmycophyta）、担子菌纲（Basidiomycetes）、担子菌亚门（Basidiomycolina）、层菌纲（Hymenomycetes）、伞菌目 （Agaricales）、 牛肝菌科 （Boletaceae）、粘盖牛肝菌属（Suillus）的一种珍稀的食、药兼用真菌[1]。点柄粘盖牛肝菌营养成分全面且含量高，具有较好的医疗保健作用，其具有的抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、提高人体免疫力等功效来源于多种生理活性物质，如多糖、维生素、矿物质等，其中以点柄粘盖牛肝菌多糖的研究为重点[2]。真菌多糖是继核酸和蛋白质之后的另一种有待深入研究的生物大分子，具有良好的生理调节作用，可以从根本上提高人体免疫力，起到强身保健的功能，因而具有广泛应用前景。

自由基与许多病理生理现象，如衰老、肿瘤、心血管疾病和炎症等有关，目前国内外已将抗氧化检测用于抗衰老等保健食品的评价，对保健品开发具有积极的作用[3，4]。本实验使用在河北燕山山区采集的点柄粘盖牛肝菌，通过热水浸提、乙醇沉淀等方法，对子实体粗多糖进行提取，在此基础上本实验进一步对点柄粘盖牛肝菌多糖的抗氧化活性进行验证，以抗氧化剂Vc作为阳性对照，以测定点柄粘盖牛肝菌粗多糖对活性氧自由基·O2-、·OH的清除能力和还原能力，并研究点柄粘盖牛肝菌粗多糖的抗氧化活性大小与其浓度的关系，为全面开发利用点柄粘盖牛肝菌在医药、食品和保健品中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

点柄粘盖牛肝菌（Suillus granulatus），采集于河北燕山山区平泉县辽河源国家级森林公园。

1.2 多糖提取

称取已干燥至恒重的点柄粘盖牛肝菌子实体6 g，在提取温度为95℃，处理时间3.5 h，料液比1∶40条件下浸提子实体多糖，3000 r·min-1离心10 min，上清液即多糖提取液。在多糖提取液中加入3倍体积95%的乙醇沉淀多糖，冷冻干燥后得点柄粘盖牛肝菌粗多糖。

1.3 点柄粘盖牛肝菌粗多糖的脱蛋白

乙醇沉淀后的粗多糖类物质中含有一定的蛋白质，按上清液体积∶Sevag试剂体积4∶1的比例加入Sevag试剂，磁力搅拌器搅拌30 min，4000 r·min-1、20 min的条件下离心，取上清液，透析、乙醇沉淀、冷冻干燥后得点柄粘盖牛肝菌粗多糖。

1.4 样品中总糖的测定

蒽酮比色法测定样品中总糖的含量[4-9]。

1.5 样品中还原糖的测定

3,5-二硝基水杨酸法测定样品中还原糖含量[9]。

1.6 样品中多糖含量的测定

多糖的含量＝总糖含量－还原糖含量。

1.7 粗多糖体外抗氧化活性测定

1.7.1 粗多糖对·OH的清除作用

采用Fenton体系测定点柄粘盖牛肝菌粗多糖对·OH的清除作用，即利用亚铁离子催化过氧化氢产生·OH，由于·OH可特异地使番红褪色，根据褪色程度用比色法来衡量·OH 的含量[9]。

反应体系中加入0.15 mol·L-1pH7.4磷酸缓冲液1.5 mL，番红花红（浓度 260 mg·L-1） 0.2 mL，0.56 mmol·L-1EDTANa2-Fe(Ⅱ)0.7 mL（新鲜配制），再加入不同浓度的多糖液0.8 mL，最后加入1%H2O20.8 mL（新鲜配制），混匀后于37℃水浴保温 30 min，3000 r·min-1离心5 min，取其上清液，在波长520 nm处测吸光度值[5]。空白组以磷酸缓冲液代替样品溶液，对照组以磷酸缓冲液代替样品溶液和EDTANa2-Fe(Ⅱ)溶液，实验结果以清除率（E1）表示，计算公式如下：

公司主导完善评价体系、拓展发展通道，加大基层站区长对职工评价的话语权、思想政治工作主动权；公司主导搭建关爱平台、建设站区文化，提升基层站区长关爱职工的亲和力、思想政治工作感染力。

E1=（A样品-A空白） /（A对照-A空白） ×100%

式中：A样品为点柄粘盖牛肝菌粗糖液吸光度值；A空白和A对照分别为空白组和对照组吸光度值。

1.7.2 粗多糖对·O2-的清除作用

采用邻苯三酚自氧化法[10]，在碱性条件下，邻苯三酚能够自氧化产生·O2-和有色中间产物（在320 nm处有最大吸收峰），·O2-又对自氧化起催化作用，依据有色中间产物生成量的多少可判断·O2-生成量的多少。加入一定量的多糖液可对·O2-产生不同的抑制作用，进而导致吸光度值的变化[11]。

取6 mL pH8.2的Tris-HCl缓冲液，移至试管中，加入一定浓度的多糖样品0.5 mL，37℃温浴10 min，最后加入37℃预热过的7 mmol·L-1邻苯三酚盐酸溶液 1 mL，混匀，精确反应4 min，立即用0.5 mL浓盐酸终止反应[12]，测320 nm处吸光度值[13]。对照组以Tris-HCl缓冲液代替糖液。空白组以Tris-HCl缓冲液代替糖液和邻苯三酚盐酸溶液。实验结果以清除率（E2）表示，计算公式如下:

E2=(A对照-A样品)/(A对照-A空白) ×100%

式中：A样品为点柄粘盖牛肝菌粗多糖液吸光度值；A空白和A对照分别为空白组和对照组吸光度值。

试验采用Oyaizu法，通过观察在多糖存在时，Fe3+-Fe2+的转移来检测其还原能力。取1.0 mL不同浓度的点柄粘盖牛肝菌多糖液，移至试管中，加入2.5 mL磷酸盐缓冲溶液（pH6.6）以及2.5 mL质量分数为1.0%的铁氰化钾溶液，混合均匀后将该体系置于50℃恒温水浴中恒温20 min，然后加入2.5 mL质量分数为10%的三氯乙酸溶液，混合均匀，置于离心机内3000 r·min-1离心10 min。移取2.5 mL上清液于另一试管中，加入2.5 mL蒸馏水及0.5 mL质量分数为0.1%的三氯化铁溶液，混合均匀，在波长700 nm处测定体系的吸光度[14-16]，吸光度值越大说明多糖的还原能力越强[13]。

2 结果分析

2.1 总糖、还原糖的标准曲线

蒽酮比色法测定总糖含量的标准曲线的回归方程为y=0.03876+7.90571x，r=0.99815；3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖的标准曲线的回归方程为y=0.03671+2.16257x，R=0.99647。

2.2 粗多糖对·OH的清除作用

采用Fenton体系测定粗多糖对·OH的清除作用，结果见图1。

由图1可知，在一定的浓度范围内，多糖对羟基自由基的清除能力随着多糖浓度的增加而增强，多糖浓度为0.2 mg·mL-1时能达到最大清除率（98.95%），而后随着多糖浓度的增加而变化不大。而Vc在浓度为0.02 mg·mL-1时清除率为80%，可见多糖对·OH的清除能力很强。

2.3 粗多糖对·O2-的清除作用

粗多糖对·O2-的清除效果见图2。

由图2可知，在一定的浓度范围内，多糖浓度越高，对超氧阴离子自由基的清除率也越高，而后随着多糖浓度的增加变化不太明显。多糖浓度为10 mg·mL-1时能达到最大清除率（21.68%），而Vc在浓度为10 mg·mL-1时清除率为97.69%，可见与Vc相比点柄粘盖牛肝菌粗多糖对·O2-的清除作用不太明显。

2.4 粗多糖的还原能力

点柄粘盖牛肝菌粗多糖的还原能力见图3。

由图3可知，点柄粘盖牛肝菌粗多糖有一定的还原能力，且还原能力随着多糖浓度的增加而增强，多糖浓度（x，mg·mL-1）与还原能力（y，%）之间的回归方程为：y=0.03004+0.00996x，R=0.98841。

3 结论

本试验通过用热水浸提点柄粘盖牛肝菌子实体，乙醇沉淀多糖Sevag法去除多糖中的蛋白，并采用Fenton体系、邻苯三酚自氧化法、Oyaizu法测定了点柄粘盖牛肝菌多糖对·OH、·O2-的清除能力和还原能力，为新药或保健食品开发研究奠定了一定的理论基础。

研究表明点柄粘盖牛肝菌多糖具有较好的抗氧化活性，具有很强的还原能力，对羟基自由基具有较好的清除作用，当多糖浓度为0.2 mg·mL-1时达到最大清除率98.95%，而对超氧阴离子的清除作用不太明显，当多糖浓度为10 mg·mL-1时其最大清除率为21.68%，而在相同条件下Vc浓度为10 mg·mL-1时，其清除率为97.69%，点柄粘盖牛肝菌多糖的还原能力良好且还原能力随着浓度的增加而增强， 多糖浓度（x,mg·mL-1）与还原能力（y，%）之间的回归方程为y=0.03004+0.00996x，R=0.98841。试验结果表明点柄粘盖牛肝菌粗多糖具有一定的抗氧化活性，尤其对其清除·OH的活性值得进一步研究和开发。

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