地塞米松对肺纤维化小鼠细胞因子及羟脯氨酸的影响

史可云,谢 婧

(江苏省宜兴人民医院内科,江苏宜兴,214200)

特发性肺纤维化(IPF)是一种由免疫介导的炎症性疾病。近年来的研究表明,细胞因子的紊乱与肺间质纤维化有密切关系。多数研究者认为,炎症细胞和细胞因子在间质性肺炎的发生发展过程中发挥着重要的作用。多种细胞因子形成复杂的细胞因子网络,通过影响肺泡上皮细胞和间质成纤维细胞的增殖和凋亡,使细胞外基质的沉积增多,抑制纤溶系统的激活等多种途径,最终促使肺纤维化持续进展[1-2]。作者观察了地塞米松对BLM致肺纤维化小鼠血清中IFN-γ、IL-4、TNF-α含量的影响及羟脯氨酸的变化,以揭示细胞因子和羟脯氨酸在肺纤维化形成过程中的意义,对肺纤维化的治疗作用及其可能机制,为临床治疗肺纤维化提供一条新的途径。

1 材 料

清洁级小鼠30只,雌雄各半,体质量(25±1.2)g;购自江苏大学实验动物中心;地塞米松品购自SIGMA公司;盐酸博莱霉素购自浙江海正药业股份有限公司;小鼠 IFN-γ、IL-4、TNF-α ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程公司;羟脯氨酸(HYP)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

2 方 法

2.1 动物分组及动物模型的制备

昆明小鼠随机分为:空白对照组、博莱霉素(BLM)组、地塞米松(DXM)组,每组10只。用气管内注入BLM(5 mg/kg)制肺纤维化模型,空白组除外。从造模次日开始,空白对照组、BLM 组分别每天灌胃生理盐水(1 mL/kg),地塞米松(DXM)组每日灌胃地塞米松(0.45 mg/kg)。

2.3 测定血清中IFN-γ、IL-4、TNF-α的含量

治疗第14天和第28天各组随机分别取5只小鼠,心脏取血处死,分离血清,采用ELISA试剂盒法进行检测。

2.4 羟脯氨酸(HYP)含量测定

精确称取肺组织湿重40 mg放入试管中,准确加水解液1 mL,混匀,置入玻璃磨口试管中加盖后沸水水浴水解20 min,水解10 min时混匀1次。调pH值至6.0～6.8。将各试管流水冷却后各管加指示剂1滴,摇匀;各试管准确加入甲液1.0 mL,混匀,此时溶液变为红色。吸取调乙液向各管内逐滴小心加入混匀,直至液体中指示剂的颜色变成黄绿色。然后加蒸馏水至10mL,混匀。取4 mL稀释的水解液,3 500 r/min,离心10 min,取上清1 mL作测定用。按测定操作采用ELISA试剂盒法进行检测。在空白管、标准管、测定管中分别加入相应试剂,放入60℃水浴15 min,冷却后,3 500 r/min离心10 min,取上清,用752紫外光栅分光光度计(波长为550 nm,1 cm比色皿,用蒸馏水调零)测定各管吸光度(A)值。根据公式计算HYP含量。HYP含量(μ g/mg湿重)=(测定管A值-空白管A值)÷(标准管A值-空白管A值)×标准管含量(5 μ g/mL)×水解液总体积(10 mL)÷组织湿重(mg)。

3 结 果

3.1 小鼠血清中IL-4、IFN-γ、TNF-α含量比较

与空白组比较,模型第14天和第28天组血清IL-4、TNF-α含量显著增加(P<0.05),IFN-γ量显著减少(P<0.05);地塞米松组与BLM 组比较,14 d和28 d组血清IL-4、TNF-α含量显著增加(P<0.01),IFN-γ量显著减少(P<0.05)。见表1。

表1 地塞米松对小鼠血清中细胞因子的影响( x±s,n=5)

3.2 小鼠肺组织中羟脯氨酸(HYP)含量的影响

BLM组各时间点Hyp含量当14 d和28 d时高于对照组,有明显增加(P<0.01)。DXM与BLM 组Hyp相比较,Hyp含量于14和28 d有明显下降(P<0.05)。见表2。

表2 3组小鼠肺组织匀浆中羟脯氨酸含量的变化(μ g/mg, x ±s,n=5)

4 讨 论

肺纤维化是多种肺部疾病的共同引起的。诱发肺纤维化的病因众多,发病机制复杂,感染、粉尘吸入、使用某些药物均可导致肺纤维化。虽然不同的病因所导致的纤维化各有特点,但主要特征性病变均为肺成纤维细胞大量增生及细胞因子。由于细胞因子失衡可能主要参与了早期肺泡炎的发生、发展有关[3-4]。

肺纤维化的实验动物模型有多种建立方法,包括抗肺组织抗体、博莱霉素、放射线、百草枯病毒、高浓度氧等均可诱发,而且均能较好地反映肺纤维化的发病过程及病理特征。TNF-α是一种具有广泛生物活性的细胞因子,与肺纤维化和间质性炎症密切相关,可诱导肺成纤维细胞等靶细胞的增殖与分化[5-6]。IFN-γ具有抗纤维化作用,TNF-α、IL-4具有促进纤维化作用。刺激细胞外基质蛋白的表达,调节细胞的增殖和分化,并在调节炎症反应和细胞介导的免疫应答方面发挥重要作用[7]。HYP是组成机体胶原蛋白的一种特有的氨基酸,几乎所有HYP都存在于胶原中,因此组织中HYP为胶原纤维所特有,其含量可作为胶原组织代谢的重要指标,因此胶原的沉积可用HYP的含量来反映,亦可作为药物疗效指标[8]。

本实验选用地塞米松对肺纤维化小鼠进行干预,实验结果显示:模型组:肺纤维化与对照组比较,第14天和第 28天时 TNF-α、IL-4细胞因子有明显升高,IFN-γ与对照组差异无显著性(P>0.05)。干预后的 14 d和28 d时TNF-α、IL-4细胞因子也有明显升高,而IFN-γ有所下降。同时模型组与干预后比较差异有显著性(P<0.05,P<0.01)。作用第7天后HYP含量差异无显著性,作用第14天和28 d后HYP含量比较差异有显著性(P<0.05,P<0.01)。提示故本研究主要选择在14 d和28 d观察地塞米松对细胞因子和羟脯氨酸异常变化的影响。使得Th1/Th2细胞因子失衡是肺纤维化的发病机制之一。即在特发性肺纤维化中Th2型细胞因子反应占优势,Th1型细胞因子相对不足促进了肺纤维化的发生、发展。使用地塞米松能够调整Th1/Th2细胞因子失衡[9-11]。早期应用地塞米松可使BLM致大鼠肺纤维化模型血清中TNF-α水平下调,推测地塞米松可能对TNF-α有阻断作用,从而起到干预肺纤维化的作用。因此地塞米松有良好的防治纤维化的作用,地塞米松能减轻肺纤维化大鼠肺组织肺泡炎及肺纤维化程度,调节Th1/Th2细胞因子失衡、TNF-α水平可能是地塞米松防治肺间质纤维化的作用机制之一。

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