内皮型氧化亚氮合酶基因G894T、胰岛素受体基因第17外显子多态性与老年痴呆的关系研究

周伟宏,吴永华

(江苏省苏州市立医院老年科,江苏苏州,215002)

近年来,随着世界人口老龄化速度的加快,老年痴呆患者逐年增加,给家庭及社会造成了沉重的负担。老年痴呆研究逐渐成为热点[1]。阿尔茨海默病(AD)与血管性痴呆(VaD)是老年人痴呆的两大主要病因。同时近年来国内外研究发现[2-3]内皮型氧化亚氮合酶基因G894T多态性、胰岛素受体基因第17外显子(1058位点)多态性与动脉硬化、高血压、冠心病、脑卒中等有关。但很少有将AD和VaD放在一起进行相关性的研究报道[4]。本研究选取阿尔茨海默病与血管性痴呆患者各50例,探讨内皮型氧化亚氮合酶基因第7外显子G894T多态性、胰岛素受体基因第17外显子多态性与老年痴呆的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2011年3月～2012年4月本院门诊及住院的AD患者50例作为AD组。经简易精神状态检查表(MMSE评分)和美国精神医学协会《精神疾病诊断与统计手册》第4版(DSM-Ⅳ)诊断为痴呆,缺血指数量表(Hachinski)评分<4分,均符合美国神经病学、语言障碍和卒中-老年性痴呆和相关疾病协会(NINCDS-ADRAD)AD诊断标准。另选VaD患者50例为VAD组,经MMSE评分和DSM-Ⅳ诊断为痴呆,Hachinski评分>7分,符合美国国立神经病学与中风研究所-神经科学国际研究协会(NINDS-AIREN)VaD诊断标准。对照组为同期收集的健康老年人50例。无糖尿病、高血压、心脏疾病及神经系统疾病,MMSE评分正常。受试者在年龄、性别、空腹血糖、甘油三酯、胆固醇、收缩压、舒张压比较均匹配(P>0.05)。见表1。

表1 3组患者一般临床资料比较( x±s)

1.2 方法

1.2.1 血液基因组DNA的提取:于肘静脉处抽取受试者清晨空腹静脉血5 mL,-20℃保存,采用全血基因组DNA提取试剂盒进行基因分析。

1.2.2 eNOS G894T基因型测定:应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法(PCRRFLP),扩增eNOS G894T基因片段的引物序列分别为:上游 5′-ACAGAATTCGCCCCGGCCTG GTACAC-3′、下游 5′-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3′。反应条件:94 ℃变性30 s,63℃退火30 s,72℃延伸1 min,40个循环,取PCR扩增产物10 μ L和酶切体系10 μ L,10×缓冲液10 μ L,去离子水3 μ L,入重蒸水使总体积为50 μ L,37℃酶切16 h,用限制性内切酶PmⅡ进行消化,取酶切产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,观察结果。

1.2.3 INSR基因第17外显子(1058位点)基因型测定:应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP),第17外显子PCR扩增引物,上游为:5′-CCAAGGATGCTGTGTAGA TAAG-3′,下游为:5′-TCAGGAAAGCCAGC C-3′。PCR完毕后,用限制性内切酶PmlI进行消化,取酶切产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,观察结果。

2 结 果

2.1 GG、GT和TT基因型分布频率

AD组、VaD组与对照组的GG、GT和TT基因型分布频率分别比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 受试者的G894T基因型分布(%)

2.2 INSR T等位基因频率

AD组患者的INSR T等位基因频率高于对照组,但差异不明显(P>0.05)。VAD组患者的INSR T等位基因频率显著高于对照组(P<0.05),GG、GT和 TT基因型分布频率和 INSR T等位基因频率在AD组和VaD组无显著差异。各基因型分布符合 Harding Weinberg定律。见表3。

表3 受试者的INSR基因第17外显子各等位基因分布[n(%)]

3 讨 论

近年来,随着对AD发病机制研究的不断深入,逐渐发现血管源性因素在AD的发生、发展中起着重要作用。许多证据表明[5]脑血管病和AD存在多种相同的血管因素。本实验从基因层面揭示AD和VaD的共性,为进一步证明AD和VaD可能并非两个独立疾患提供新的证据,也为将来可能的基因治疗提供新的途径。到目前为止,已经发现了十多种eNOS的基因多态性位点[6],其中内皮型氧化亚氮合酶基因G894T突变与原发性高血压、冠心病存在相关关系[7]。本研究通过应用PCR-RFLP,发现AD组患者和VaD组的GG、GT和 TT基因型分布频率与对照组患者相应的基因型分布频率比较,差异都有统计学意义(P<0.05),表明内皮型氧化亚氮合酶基因G894T的多态性与AD和VaD的发生、发展可能存在相关性。该研究结果可能对阿尔茨海默病以及血管性痴呆的基础研究和临床防治有一定指导意义。Watanabe等[8]的研究提示动脉粥样硬化可能为AD和VaD的独立危险因素,可能由于不同地区人种的差异导致。

近年来胰岛素受体基因第17外显子多态性被证实与动脉粥样硬化、高血压病、糖尿病的独立危险因素[9]。胰岛素/胰岛素受体信号级联系统正常运行也是维持大脑血液运行和能量代谢正常进行的关键因素。本研究发现AD组患者和VAD组患者的INSR T等位基因频率高于对照组,可能是由于胰岛素受体mRNA定位于神经元的胞体上,在海马和额叶前皮层齿状回和海马CA1和CA3区有大量的胰岛素受体分布。海马CAI和齿状回的胰岛素受体mRNA上调和胰岛素受体增多可以改善学习过程,胰岛素及胰岛素信号系统可能直接参与认知功能[10-12]。可以推测胰岛素受体缺陷导致大脑神经细胞胰岛素信号传导障碍可以引起认知功能障碍,这与孙红[9]相关性结果一致。本研究GG、GT和 TT基因型分布频率和INSR T等位基因频率在AD组和VaD组无显著差异。可能提示AD和VaD在基因层面存在着共性,也可能由于样本量较少未统计出差异,有待于进一步研究证实。

综上所述,由于目前对于AD和VaD的早期诊断、早期干预成为热点,但至今无针对AD和VaD有效的治疗方法。要找到有效的方法,就需要大量更深入的研究,更详尽揭示AD和VaD的本质及发病机制,本研究证实AD和VaD存在相同的基因危险因素[13-14],为更深入的揭示AD和VaD的发病机制及2者间共性提供新的证据。

[1] 谭建聪,祝之明,祝善俊,等.重庆部分高血压患者氧化亚氮合酶基因G894T多态性与相关危险因素的研究[J].中华心血管病杂志,2004,25(2):158.

[2] Zhao Q,Su S Y,Chen S F,et al.Association study of ten dothelial nitric oxide syntheses gene polymorphism with essential hypertension in northern Han Chinese[J].Chin Med J(Eng 1),2006,119(13):1065.

[3] 黄跃斌,何印蕾.ApoE基因多态性、hs-CRP与冠心病的相关性研究[J].中国老年医学杂志,2009,29(11):2864.

[4] Reif A,Herterich S,Strobel A,et a1.A neuronal nitric oxide synthase(NOS-I)haplotypeassociated with schizophrenia modifies prefrontal cortex function[J].Mol Psy chiatry,2006,11(3):286.

[5] Luchsinger JA,Reitz C,Honig LS,et al.Aggregation of vascular risk factors and risk of incident Alzheimer disease[J].Neurology,2005,65:545.

[6] Yoon S,Shin C,Park H Y,et al.Endothelial nitric oxide synthase gene is associated with vessel stenosis in Korean population[J].Clin Clim Acta,2005,353(1-2):177.

[7] 张 晶,关 欣,梁 蓉,等.内皮型氧化亚氮合酶基因G894T多态性与颈动脉粥样硬化的相关性[J].中华老年心脑血管病杂志,2011,13(7):633.

[8] Watanabe T,Miyazaki A,Katagiri T,et al.Relationship between serum insulin-like growth factor-1 levels and Alzheimer's Disease and vascular dementia[J].J Am Geriatr Soc,2005,53:1748.

[9] 孙 红.胰岛素受体基因第17外显子多态性与血管性痴呆的相关性[J].河北医科大学学报,2010,31(8):960.

[10] Zhao W Q,T ownsend M.Insulin resistance and amyloidogenesis as common molecular foundation for type 2 diabetes and Alzheimer′s disease[J].Biochim Biophys Acta,2009,1792(5):482.

[11] 吴映曼,蔡 毅,周 亮.血管性痴呆患者的执行功能障碍[J].南方医科大学学报,2010,30(8):1974.

[12] 杨红芳.康复治疗对老年血管性痴呆患者疗效及认知功能障碍的影响[J].南方医科大学学报.2010,30(6):1450.

[13] 王圣秋.30例老年痴呆患者吞咽困难相关因素的调查分析[J].实用临床医药杂志,2010,14(20):119.

[14] 张小亦,谢林珠.长春西汀联合石杉碱甲治疗皮质下缺血性痴呆的临床疗效观察 [J].实用临床医药杂志,2010,14(23):72.