硫酸酯化茯苓多糖对裸鼠胃腺癌的抑制研究

李云桥,侯晓华,王艺峰,张俐娜

(华中科技大学同济医学院附属协和医院,1.老年科;2.消化内科,湖北武汉,430022;3.武汉大学,湖北 武汉,430074)

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,随着社会人口老龄化,老年胃癌患者的人数正逐年增加,成为胃癌发病的主体人群[1]。由于老年人胃癌多为中晚期,且老年人免疫功能低下,夹杂病症多,对放化疗的耐受的也差,因此合理应用辅助化疗与免疫生物治疗等综合疗法是提高老年人胃癌中位生存期的重要途径[2]。研究表明,一些天然多糖具有增强机体免疫活性[3]和显著抗肿瘤[4-5]作用,目前多糖已广泛用于食管癌、胃癌、肝癌的辅助治疗[6]。茯苓一直是最重要的传统中药之一。本组前期研究表明[7],硫酸酯化茯苓多糖(SPCS3-II)有显著的体外抗胃腺癌作用,且对低分化的胃腺癌细胞株MKN-45的抑制有较好的剂量依赖性。因此为进一步探讨其在体内的抑制效果,本实验选用裸小鼠进行了体内活性实验。应用裸鼠人胃癌移植瘤模型研究硫酸酯化茯苓多糖对裸鼠人胃癌移植瘤生长的抑制作用,旨在为胃癌的辅助化疗和免疫生物治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

样品由武汉大学化学系张俐娜院士课题组提供,包括从新鲜茯苓菌核的0.5 M NaOH提取物(1※3)-β-D-葡聚糖PCS3-II,以及以PCS3-II为原料制备的硫酸酯化S-PCS3-II,样品制备所用试剂为分析纯。SPF级裸小鼠BalB/CA nu品系40只,4周龄,平均体重(18.5±0.7)g,均为雄性(中国医学科学院动物研究所提供)。

1.2 样品制备

茯苓菌核多糖提取和纯化、硫酸酯化茯苓多糖制备方法见文献[8-9]。

1.3 方法

1.3.1 细胞复苏:在液氮罐中取出冻存的低分化程度的胃腺癌细胞株MKN-45,在37℃水浴中融化,离心,2 500 rpm×5 min。去上清,用RPMI1640培养液洗一次,接种于25 mL的培养瓶中,加8ml含10%胎牛血清的RPMI1640培养液。放二氧化碳培养箱中培养(37℃,50 mL/LCO2),次日换培养液1次。

1.3.2 细胞传代:在显微镜下观察细胞生长情况,如生长正常且基本长满瓶底时即可传代,2～3 d传1次。去培养上清液,用37℃水浴预热的含0.02%EDTA的PBS(0.01M)消化细胞 7 min,去消化液,加16 mL含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,震摇均匀后分装在两个培养瓶中,放CO2培养箱中培养(37℃,50 mL/L)。

1.3.3 接种细胞悬液制备:无菌操作体外培养的MKN-45细胞3瓶装25 cm规格的培养瓶,瓶内贴壁生长的人胃腺癌细胞系MKN45细胞,生长达80%汇合;在每瓶中各加入0.25%胰酶1 mL后,置 37℃孵育5 min左右,进行消化;取出培养瓶,置倒置显微镜下观察,见胞质回缩、细胞间隙增大,此时倾去胰酶溶液,每瓶中加入含新鲜10%小牛血清的RPMI1640培养液中10 mL终止消化;收集此悬液1 000 rpm离心×3 min,倾去上清液;离心,洗涤细胞2次;取生理盐水6 mL吹散混匀被离心的细胞后,取0.1 mL稀释10倍;用0.4%台盼蓝染色后,血细胞记数活细胞;当活细胞比率>95%,调整细胞浓度至4×106个细胞/mL时,准备接种。

1.3.4 抗肿瘤活性试验:①皮下接种:抽吸出0.2 mL的细胞悬液,接种在32只裸鼠右侧下肢腹股沟皮下;②分组及给药:40只SPF级裸小鼠共分5组,包括正常饮水饮食1组(8只),瘤体接种后1周将荷瘤鼠随机分为4组:生理盐水(阴性对照)组、低剂量治疗组、高剂量治疗组、5-氟尿嘧啶(5-Fu)(阳性对照)化疗组,每组8只。皮下接种24 h后给药,治疗组给以茯苓多糖腹腔注射,低剂量治疗组25 mg/(kg·d),高剂量治疗组250 mg/(kg·d),化疗组第1、3、5天腹腔注射 5-Fu,50 mg/(kg·d);每组每次腹腔注射量为0.2 mL,连续给药3周。

1.4 观察指标

①观察成瘤情况并记录。②病理形态观察:解剖荷瘤鼠,大体观察移植瘤生长状况与周围脏器受累及情况;腹腔内淋巴结转移情况;主要脏器(肝、肺、肾)有无转移灶;腹水的量与性状。另取部分瘤组织/淋巴结及主要脏器于光学显微镜下观察。部分瘤组织在电镜下观察。③计算肿瘤抑制率(ξ)和体重变化率(f)。ξ=[(Wc-Wt)/Wc]×100%;f=[(Wa-Wb)/Wb]×100%。处死裸小鼠后,从皮下完整剥离取出肿瘤组织,剔出纤维薄膜,于电子天平上称取瘤重W,式中Wt为注射样品组和阳性对照组裸小鼠组肿瘤的平均重量,Wc为阴性对照组肿瘤的平均重量,Wb和Wa分别为给药前后的裸小鼠组平均体重。将试验组瘤块的重量与对照组比较,观察以上试样对肿瘤生长的抑制作用。

2 结 果

2.1 肿瘤组织病理学观察

移植瘤生长状况:皮下移植后1周左右可于皮下触及包块,随后肿瘤结节逐渐生长增加,4周时阴性对照组肿块可达到1.3 cm×0.4 cm左右,大部分动物消瘦明显,活动欠佳。裸鼠皮下移植瘤成功率为100%,瘤块多呈圆形、实质形,表面有结节状隆起,呈淡红色鱼肉状,且瘤块与周围组织粘连不明显,包膜完整,与基底和周围组织粘连不明显。

2.2 病理切片光镜下显示

瘤体组织均为胃腺癌细胞,核大小不一,染色深,细胞间质少。瘤细胞排列呈索状或巢状,无明显腺体结构存在,阴性对照组瘤组织中瘤细胞大,呈椭圆形,胞浆红染,细胞核大而色深,核浆比例失调,而在化疗组与治疗组中,瘤细胞相对较小,核浆比例也相对接近正常,胞浆中有空泡,核结构模糊(见图1)。未见腹水、淋巴结和其他脏器转移。

图1 瘤体组织苏木精-伊红色(H.E染色)

2.3 肿瘤大小及肿瘤抑制率变化

与空白对照组比较,荷瘤裸小鼠体重增长缓慢,有显著性差异(P<0.05),能明显抑制肿瘤的生长,与阴性对照组比较,有显著性差异(P<0.05),但高低剂量在抑制肿瘤生长和体重增长方面没有显著性差异(P>0.05),与5-Fu组抑瘤率(58.3%)相比,硫酸酯化茯苓多糖抑瘤率低于5-Fu组,但体重增加率远高于5-Fu组,有显著性差异(P<0.05)。总之,硫酸酯化茯苓多糖能有效抑制胃腺癌的增长,在改善荷瘤裸鼠的生长状况,与阴性对照组和5-Fu组比较有显著性差异(P<0.05),优于5-Fu组。见表1。

表1 硫酸酯化茯苓多糖对裸小鼠皮下胃腺癌移植瘤的抑制作用( x±s)

3 讨 论

茯苓长期以来作为传统中药在中国和许多亚洲国家被广泛应用,它具有很高的保健功能和药用价值。从茯苓中提取的多糖能抑制白血病细胞株HL-60的生长,且和其他多糖联用可以增强其抗肿瘤活性,茯苓多糖在体内外都能抑制S-180的生长,在体外能抑制白血病细胞株HL-60和肝癌细胞株HepG2的生长,在前期的实验中,本组取从茯苓菌核中提取分离出的碱溶性多糖PCS3-II的5种衍生物进行了体外抗胃腺癌抑制试验,得知硫酸酯化茯苓多糖在体外对胃腺癌细胞株MKN-45有较好的抑制率,且呈剂量依赖性[7]。为了进一步研究其在体内的抑癌效果,本研究选用裸小鼠进行了体内抗胃腺癌移植瘤的实验,也取得了预期实验结果。Chen X等[10]报道硫酸酯化茯苓多糖通过免疫增强行抗肿瘤作用,说明对茯苓多糖进行硫酸酯化衍生是一种有效的方式,能有效地增强机体免疫作用而发挥对胃腺癌的抑制作用。

裸小鼠胃癌移植瘤模型也相继建立,具有很好的稳定性和简单易行的特点,且裸小鼠皮下移植瘤模型稳定、方便易行。本实验在32只裸小鼠皮下接种胃腺癌MKN-45细胞株,结果显示腹股沟皮下接种致瘤率100%,主要原因为腹股沟皮下血管丰富,有利于胃癌细胞的生长,裸小鼠移植瘤生长4周后处死,解剖发现瘤体组织均为胃癌细胞,且肿瘤组织周围有膜包裹,病理切片检查心、肺、肝、脑、肾、胰均未发现有癌细胞转移,有文献报导,皮下接种致瘤不容易发生转移。本实验结果与此一致[11-13]。

本实验结果表明,不同剂量的硫酸酯化茯苓多糖都能有效地抑制胃腺癌的生长,硫酸酯化茯苓多糖不像5-Fu那样有很强的细胞毒性,在杀死肿瘤细胞同时也杀死正常细胞。高剂量组的抑制率达到47.9%,且能改善机体的生长状况。硫酸酯化茯苓多糖衍生物值得进一步研究开发,以期为抗胃腺癌辅助化疗和免疫生物治疗的进一步研究、开发和利用提供重要科学依据。

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