羊栖菜岩藻黄质色素的抗氧化性研究

汪财生，王 璐，刘丽平，李彩燕，钱国英 ，杨义右

(浙江万里学院生物与环境学院，浙江宁波315100)

羊栖菜(Sargassum fusiforme)属于褐藻门马尾藻科，在我国广东、福建、浙江等地海域均有分布，其中含有多种抗肿瘤和改善人体免疫的活性成分，对高血压、大肠癌等均有一定疗效，具有较高的营养和药用价值［1-2］。岩藻黄质(fucoxanthin)又称岩藻黄素、褐藻黄素，具有共轭双键，且含有丙二烯和环氧烷结构，属类胡萝卜素类色素［3］，广泛存在于各种藻类、海洋浮游植物、水生贝壳类等动植物中［4-5］。国外曾报道岩藻黄质可以抑制视黄醇缺陷引起的氧化压力，且其抑制效果强于β-胡萝卜素［6］。因此，羊栖菜中提取的岩藻黄质类色素产品可能具有清除自由基及抗氧化等功能活性。本文从还原力、抗脂质过氧化功能进行评价，并在清除DPPH·基础上，采用荧光化学发光法进一步研究羊栖菜岩藻黄质类色素粗品对活性氧自由基的清除能力，为其深度研究及开发应用提供新的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

羊栖菜 购于浙江温州洞头县，5～6 月新鲜藻体，清水冲洗藻体表面泥沙、盐粒，沥干后于-20℃冰柜中储藏，实验前取冰冻藻体真空冷冻干燥，粉碎过60 目筛于-20℃冰箱中避光密封保存备用;岩藻黄质标准品 Sigma，≥99%;H2O2上海哈勃，≥30%;鲁米诺 南京探求，≥98%;BHT 德国拜耳，99.8%;VC、VESigma，≥98%;DPPH Sigma，≥95%。

SFE-2 超临界CO2萃取仪 美国ASI;ALPHA1-4/2-4LSC 冷冻干燥机 德国Christ;Cary50 紫外分光光度计 美国Varian;BC-027-TY6876 化学发光检测仪 美国Beckman。

1.2 实验方法

1.2.1 羊栖菜岩藻黄质类色素粗品的制备 称取一定质量的羊栖菜干粉，参考Myong-Kyun Roh 等［7］报道的超临界CO2提取裙带菜中岩藻黄质方法改进，于提取压力30MPa、温度50℃的条件下超临界CO2萃取1.5h，冷冻干燥得红褐色岩藻黄质粗品固体粉末，置于红棕色样品瓶-18℃保存备用。参考尹尚军等［8］的方法，HPLC 测定色素干粉中岩藻黄质含量7.36%。

1.2.2 还原力的测定 参考张福娣报道的方法［9］并略作调整，取一定浓度的待测液0.5mL，加0.2mol/L、pH6.6 的磷酸盐(PBS)缓冲液和1% 的K3Fe(CN)6溶液各1.25mL，混匀，将混合液50℃保温20min 后，加10%的三氯乙酸溶液2.5mL，混匀，1500r/min 离心10min。取上清液2.5mL，加2.5mL 蒸馏水及0.1%的FeCl31mL，混匀，10min 后检测OD700nm值。实验分别配制不同浓度的100、200、400、800、1000μg/mL 岩藻黄质粗品、VC、VE，进行还原能力评价。

1.2.3 DPPH 法测定清除自由基能力 参考文献［10-11］，精确称取40mg 的DPPH·，用无水乙醇溶解、定容至500mL，配成2 ×10-4mol/L 的DPPH·溶液，置于棕色瓶备用。取DPPH·溶液2mL 加入到2mL 一定浓度的待测液中，充分混匀。室温静置30min 后检测OD517nm值。样品DPPH·的清除率可由公式(1)计算。实验分别配制不同浓度的100、200、400、800、1000μg/mL 岩藻黄质粗品、VC、VE，进行DPPH 清除率评价。

式中，Ae=2mL DPPH·溶液+2mL 无水乙醇的OD517nm值;Ai=30min 反应后2mL DPPH·溶液+2mL待测溶液的OD517nm值;Aj=30min 反应后2mL 无水乙醇+2mL 待测溶液的OD517nm值。

1.2.4 羟自由基清除能力测定 实验用鲁米诺化学发光法测定Fenton 反应产生·OH 的清除能力，按文献［12］方法，调整H2O2量，化学发光仪中快速启动发光反应，记录每间隔2s 发光强度值，至出现峰值，共180s 积分峰值CP1，同时用甲醇做空白对照，其发光强度积分峰值记为CP0，则·OH 的清除率由公式(2)计算。实验分别配制不同浓度的100、200、400、800、1000μg/mL 岩藻黄质粗品、VC、VE，进行·OH清除率评价。

式中，CP0-甲醇的空白发光积分值;CP1-待测液的发光积分值。

1.2.5 超氧阴离子自由基清除能力测定 参考文献［12］，以化学发光法分别测定100、200、400、800、1000μg/mL 不同浓度的岩藻黄质粗品、VC、VE对非酶体系碱性连苯三酚产生的O-2·的清除能力。在反应池中加50μL 的5mmol/L 的鲁米诺溶液和不同浓度待测液50μL，充分混匀，再加100μL 的6mmol/L 的连苯三酚溶液，快速于发光仪中启动反应，每2s 测定一次发光强度，至出现峰值，积分值CP1。同时用甲醇作空白对照，其发光强度积分值记作CP0，则O2-·的清除率由公式(3)计算:

式中，CP0-甲醇的空白发光积分值;CP1-待测液的发光积分值。

1.2.6 过氧化氢清除能力的测定 参考吕晓玲等［12］报道的方法，用鲁米诺化学发光法，在反应池中加50μL 待测液，1mol/L 鲁米诺溶液50μL，pH9.5 的碳酸缓冲液100μL，充分摇匀后，加体积分数0.15%的H2O2溶液50μL，开启反应，每2s 测定一次发光强度，至出现峰值，积分值CP1，以甲醇作为空白对照，其发光强度积分值记作CP0，则H2O2的清除率由公式(4)计算。实验分别配制不同浓度的100、200、400、800、1000 μg/mL 岩藻黄质粗品、VC、VE，进行H2O2清除率评价。

式中，CP0-甲醇的空白发光积分值;CP1-待测液的发光积分值。

1.2.7 抗脂质过氧化功能的测定 参考邓胜国等［11］报道的方法略作调整，用亚油酸加速氧化法测定岩藻黄质粗品的抗脂质过氧化功能。将不同浓度的待测液0.2mL 分别加至具塞试管中，再加2.5%的亚油酸1mL 和0.05mol/L 的PBS 缓冲液(pH7)0.8mL，置于45℃恒温培养箱中，空白对照用0.2mL 无水甲醇代替待测液。每隔24h 取45℃恒温培养液0.05mL，加75%甲醇4.85mL 和30%硫氰酸铵0.05mL，再加3.5%HCl 配制的0.02mol/L 的FeCl2溶液0.05mL，反应3min，用分光光度计测定OD500nm值，考察亚油酸过氧化物生成量。

1.2.8 数据处理 实验数据均采用Excel 进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 羊栖菜岩藻黄质类色素粗品还原能力

还原性是一种物质抗氧化能力的一个重要指标，也是物质抗氧化机理之一。一般情况下样品的还原能力与抗氧化活性之间呈显著的相关性［13］，即反应后吸光值的大小直接反映还原力强弱，吸光值越大，抗氧化活性越强。羊栖菜岩藻黄质粗品与对照品VC、VE还原能力如图1 所示，均表现为与样品浓度呈正相关，相关系数R2分别为0.991、0.986、0.998。VC、VE还原能力较强，随样品浓度增加而呈增强趋势明显，而岩藻黄质粗品表现为最低，且增加样品浓度还原能力增强缓慢。原因可能是还原体系的酸及温度条件影响岩藻黄质粗品的稳定性，还原能力不明显。

2.2 清除DPPH·能力

图1 VC、VE、岩藻黄质粗品的还原能力(sd)Fig.1 Reducing power of VC，VE and fucoxanthin

按照1.2.3 的方法测定岩藻黄质粗品、VE、VC对DPPH·的清除率，结果如图2 所示，在100～1000μg/mL实验浓度范围内，岩藻黄质粗品、VE、VC对DPPH·的清除率均随着浓度的增加而增大，均呈良好的剂量-效应的线性关系，其相关系数R2分别为0.994、0.993、0.915。VEDPPH·的IC50为267.314μg/mL，清除效果最好。VC次之，为357.068μg/mL。而岩藻黄质的DPPH·的IC50达到565.2μg/mL，为VE的211.4%;但浓度为1000μg/mL 时，岩藻黄质的DPPH·清除率达到88.79%，与同浓度VC清除率(90.07%)相当，仅低于VE8.25%;当浓度为200μg/mL 时，DPPH·清除率为21.61%，略高于杨立群［14］通过硅胶柱层析获得的海带岩藻黄质产品浓度为270μg/mL 时的19.85%。

图2 岩藻黄质粗品、VE、VC 的DPPH 自由基清除能力(x¯±sd)Fig.2 Scavenging activities of fucoxanthin，VE and VC on DPPH·

2.3 清除·OH 能力

岩藻黄质粗品、VC、VE对由Fenton 反应体系产生·OH 的清除效果如图3 所示，三个样品在浓度为100～1000μg/mL 时，对·OH 清除的效果表现良好的量效关系，其相关系数R2分别为0.971、0.967、0.982。样品对·OH 的IC50分别为386.29、650.28、253.35μg/mL，当受试浓度至1000μg/mL 时，其·OH 清除率分别为81.22%、65.33%、93.21%，表明该岩藻黄质粗品清除·OH 作用仅次于VE，远强于VC，具有较好地·OH清除效果。因此，选用天然岩藻黄质粗品制成保健品等，具有防衰老、预防疾病的重要意义。

2.4 清除O2- ·能力

清除O2-·能力结果如图4 所示。在浓度为100～1000μg/mL 范围内，岩藻黄质粗品、VE、VC对由碱性连苯三酚体系产生的O2-·清除效果均随其质量浓度的增加而增强，相关系数R2分别为0.900、0.959、0.960，具有良好的量效关系;各样品O2-·清除率的IC50分别为615.71、469.45、355.27μg/mL，即对O2-·清除率作用大小是VC＞VE＞岩藻黄质粗品。当浓度达1000μg/mL 时，岩藻黄质粗品、VC、VE对O2-·的清除率相当接近，分别为83.98%、87.75%、85.54%，即岩藻黄质粗品的O2-·的清除率略低于VC与VE。而严小军等［15］采用硅胶柱层析纯化获得的鼠尾藻岩藻黄质产品浓度为10μg/mL 时，O2-·清除率为7.9% ±0.4%，高于VE的6.9% ±2.6%。推测由于岩藻黄质产品纯度及不同藻类来源的区别所致。

图3 岩藻黄质粗品、VC、VE 的·OH 清除能力(sd)Fig.3 Scavenging activities of fucoxanthin，VC and VE on·OH

图4 岩藻黄质、VE、VC 的O -2 ·清除能力(sd)Fig.4 Scavenging activities of fucoxanthin，VE and VC on O -2 ·

2.5 H2O2 清除能力

按照1.2.6 方法测定岩藻黄质粗品对H2O2的清除率，结果如图5 所示。样品在浓度为100～1000μg/mL范围内，也具有良好的量效关系，随样品浓度增加H2O2的清除率增强，岩藻黄质粗品、VE、VC的相关系数R2分别为0.898、0.955、0.921。岩藻黄质粗品对H2O2的IC50为658.74μg/mL，清除能力小于VC、VE，但对H2O2清除作用在受试浓度范围内效果明显，清除率由14.86%增大到71.51%。实验表明岩藻黄质粗品及标准对照品VC、VE都可作为H2O2清除剂。

图5 岩藻黄质、VC、VE 的H2O2 清除能力(sd)Fig.5 Scavenging activities of fucoxanthin，VC and Ve on H2O2

2.6 抗脂质过氧化功能

如图6 所示，亚油酸在45℃条件下保温时，过氧化作用十分显著，加入抗指质氧化剂岩藻黄质粗品、BHT、VC后，过氧化作用能明显受到抑制，均随着样品浓度的增加，其抗脂质过氧化作用增强，并在实验期内表现稳定。岩藻黄质粗品受试各浓度及实验期内的吸光值均小于400μg/mL VC的吸光值，表明岩藻黄质粗品的抗脂质过氧化作用远远强于VC。但岩藻黄质粗品总体对脂质氧化的抑制约为BHT 的50%。实验浓度范围内抗脂质过氧化功能的强弱顺序依次为BHT、岩藻黄质粗品、VC。实验表明岩藻黄质粗品具有较强的抗脂质过氧化功能，是一种优良的天然抗氧化剂。

图6 岩藻黄质、VC、BHT 对脂质过氧化的抑制能力(sd)Fig.6 Restraint activities of fucoxanthin，VC and BHT on lipid peroxidation

3 结论

超临界CO2提取的羊栖菜岩藻黄质色素产品属于天然类胡萝卜素，体外抗氧化实验表明，在被试浓度范围内的还原能力表现不强，但对DPPH·、·OH、O2-·等自由基及H2O2均表现出较强的清除能力，其中对·OH 的清除能力高于对照品VC，IC50为386.29ug/mL，远低于VC的650.28ug/mL;对O2-·的清除能力与VC相当。此外，岩藻黄质粗品的抗脂质过氧化功能明显强于VC。因此，羊栖菜中岩藻黄质粗产品是一种具有良好抗氧化功能的天然食用色素，可用于食品的着色、防止许多由体内脂质过氧化和自由基损伤引起的疾病，起到一定的保健作用。本研究使用的是羊栖菜岩藻黄质色素粗品，成分比较复杂，主要包括岩藻黄质、岩藻黄醇、脂类等物质，可通过进一步纯化提高羊栖菜岩藻黄质纯度，有望成为一种天然的新型高效抗氧化剂成分在食品、化妆品及保健品上得到开发利用。

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