生香酵母发酵改善烟梗提取液性质研究

周 瑢，孔浩辉，何艳明，程志颖，张心颖

(广东中烟工业有限责任公司，广东广州510145)

烟梗即是烟叶之粗硬叶脉，约占烟叶重的25%～30%，是烟草工业的主要副产物［1］。作为烟草生产大国，我国每年约有数十万t烟梗废弃物没有得到合理的处理而被弃置。既对环境造成了污染，同时也是对自然资源的浪费［2］。生产烟草薄片是烟梗高值化利用的主要形式，目前世界卷烟工业对造纸法烟草薄片的使用越来越普遍，使用造纸法烟草薄片是烟草工业的发展趋势［3］，该法是利用烟梗和废弃烟叶(碎片、烟末)，经浸取、打浆、调浆、抄片和涂布等工艺过程加工而制成重组烟叶。烟梗是制造烟草薄片的重要原料［4］，其比例可占到总量的50%～80%。但烟梗经浸取、打浆、调浆等工艺过程，所得的烟梗提取液中含有较多蛋白质、淀粉、果胶等大分子，导致烟草薄片存在杂气重、刺激性大和口感不适等吸味缺陷，最终影响到烟草薄片的感官质量。国内外研究表明［5－7］，通过微生物发酵能够大大缩短烟叶醇化的时间，明显消除烟叶的青杂气，减轻刺激性，并且对烟叶香气质量的改善有一定的促进作用。本文采用生香酵母对烟梗提取液进行发酵处理，研究生香酵母发酵对烟梗提取液的各项性质的影响，对微生物发酵改善烟梗提取液性质的可能性进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

烟梗 广东中烟工业有限责任公司原料研究所提供;柠檬酸、柠檬酸钠、二氯甲烷、无水硫酸钠 均为分析纯;安琪生香酵母 本实验室从安琪酵母粉上分离获得;YPD培养基。

7890气相色谱仪 美国Agilent公司;1200型高效液相色谱仪 美国Agilent公司，配备G1378B脱气机、G1311A四元泵、G1329A自动进样器、G1316A柱温箱和G1362A示差折光检测器;CP2245电子天平 感量0.0001g，德国 Sartorius公司;DSHZ－300A恒温水浴摇床 太仓市实验设备公司;ZHWY－200D恒温气浴摇床 上海智诚;QZ－18(B7)电磁炉 广州市九阳家电有限公司;FZ102粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;Centrifuge 5804R离心机 德国Eppendorf;50mL圆底烧瓶，250mL三角瓶，容量瓶等玻璃仪器;731型紫外－可见分光光度计、DSX－280A型高压灭菌锅 上海;SVE－4A1无菌操作台 新加坡ESCO;HP250S电热恒温培养箱 湖北。

1.2 烟梗提取液的制备

取10.0g烟梗粉末于250mL三角瓶中，加入8倍重量的水，于50℃恒温水浴摇床，250r/min转速下振荡提取1h，如此反复三次，合并液体，得到烟梗提取液。

表1 发酵过程中酵母菌数及发酵液pH的变化Table 1 Changes of the yeast number and fermentation broth pH during fermentation

1.3 烟梗提取液发酵

将生香酵母菌株转接到YPD培养基斜面，于30℃活化培养12h。取数个250mL三角烧瓶，在每个烧瓶中装入烟梗提取液200mL，放入高压蒸气灭菌锅，于115℃灭菌20min，冷却至室温，待用。取一活化培养好的生香酵母菌株斜面，吸取5mL无菌水洗下菌落，制成菌悬液。在一瓶已灭菌的烟梗提取液培养基中接入1mL菌悬液，放入30℃的培养箱中发酵培养2d;同时，在2瓶已灭菌的烟梗提取液中各加入同样量的无菌水，并在同样条件下进行处理(对照)。将接菌和未接菌发酵的烟梗提取液分别作为发酵样品和对照样品进行分析检测或提取分离。在发酵过程中每隔12h监测其pH、酵母菌数、各种单糖含量及主要的香气成分量。

1.4 测定方法

1.4.1 有机酸成分的测定［8］称取2g烟梗提取液置于15mL具塞离心管中，加入100μL己二酸内标溶液，加入2mL 10%(V/V)硫酸甲醇溶液，振摇5min，室温放置过夜，进行甲酯化反应。然后加入5mL去离子水，5mL氯仿，萃取后离心(2000r/min)，取下层清液进样。

气相色谱条件:DB－5(60m×0.32mm×0.25μm)毛细管色谱柱(J＆W 公司);进样量:1μL，不分流进样方式;进样口温度:250℃;载气:He，2.2mL/min;程序升温:45℃下保持2min，然后以6℃/min的速率升至180℃，再以10℃/min的速率升至 260℃，保持10min;检测器:FID;检测器温度:300℃。

1.4.2 高效液相色谱测糖含量 称取一定量的已粉碎的烟草样品，以50%的乙腈水溶液振荡萃取样品30min，取液体过 0.45μm有机滤膜，上液相色谱分析。

液相色谱条件:Waters X bridge Amide(4.6mm×250mm，3.5μm)糖分析柱;柱温85℃;RID 检测器;流动相:70%(体积分数)乙腈/30%水预混合溶液，等梯度洗脱;进样量:10μL;进样模式:洗针进样;流速:0.8mL/min;停泵时间:20min。

1.4.3 主要香气成分检测方法［9］称取15g提取液，以二倍体积的二氯甲烷超声提取20min，分液漏斗过滤，水相再以二倍体积二氯甲烷超声提取20min，反复三次，收集二氯甲烷相，45℃常压旋转蒸馏二氯甲烷萃取液至1mL浓缩液，加入无水硫酸钠去除水分，进行气质分析。

GC条件如下:色谱柱:DB－FFAP(30m×0.25mm×0.25μm);载气:He，流量 1.0mL/min;分流比30∶1;进样量为1μL;进样口温度:250℃;程序升温:60℃，维持2min，5℃/min升至250℃，维持10min。MS条件如下:传输线温度:260℃;离子源温度:230℃;四级杆温度:150℃;电离电压:70eV;质量数范围:50～550amu;MS谱库:Wiley05+Nist08串联检索;采用丙酸苯乙酯内标法定量。

1.4.4 pH测定方法 将发酵液冷却至室温，以pH计测定其pH。

1.4.5 发酵液中酵母菌数测定 采用平板菌落计数法。

2 结果与讨论

2.1 发酵过程中生香酵母菌数的变化和发酵液pH的变化

对发酵液pH进行测定，结果如表1所示。在接种前，生香酵母菌菌悬液的酵母菌数为2.7×104个，处于对数生长期，酵母菌菌数显著增加，24h后达到2.63×107个，几乎增加了1000倍。随着发酵时间的延长，酵母发酵由生长期转向稳定期，菌数增加缓慢，24～48h，酵母菌数增长不到10%。48h后，进入衰亡期，故发酵时间不能超过48h。发酵过程中，发酵液pH随发酵时间先降低后趋于平衡，0～12h发酵液pH降低最大，降低了0.95;12～24h发酵液pH仍然降低，但降低较小，12h后发酵液pH维持在4.40左右。

2.2 发酵过程中烟梗提取液中各种糖含量变化

糖对卷烟燃吸口味有重要的积极作用，对发酵过程中各种糖的量进行测定，采用HPLC考察了发酵过程中葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖的含量(图1)，可以看出葡萄糖在0～24h显著降低，此时由于菌体大量的生长繁殖，需要大量的直接能源;24h后菌体生成达到稳定期，生长缓慢，其含量变化不大。果糖、蔗糖和麦芽糖在整个过程中变化不显著。从而可以得出，生香酵母在发酵过程中，主要以葡萄糖作为其碳源提供其生产繁殖所需的能量，后续在发酵液的处理过程中，为平衡发酵液性质，更好地用于烟草行业，需补充葡萄糖。

图1 发酵过程中几种糖随发酵时间的变化Fig.1 Changes of several sugar contents during fermentation

2.3 发酵过程中有机酸含量的变化

有机酸在卷烟燃吸过程中能醇和吸味，降低燃吸的刺激性。为了更深入地了解发酵对烟梗提取液中有机酸性物质的影响，采用有机酸的气相色谱分析法检测烟梗提取液中的有机酸性物质。结果见表2，烟梗提取液中，半挥发性有机酸(主要为高级脂肪酸)，棕榈酸、油酸、亚油酸和硬脂酸的含量基本相当。在发酵过程中，非挥发性酸含量随时间变化显著，乳酸和丙二酸在12h时，含量达到最大，随后又随时间变小并趋于恒定，而乙酰丙酸含量在整个发酵过程随时间不断增大。有机酸总量在48h达原含量的2.8倍。

表2 发酵过程中各种有机酸含量(mg/mL)Table 2 Organic acids contents during fermentation(mg/mL)

表3 不同发酵时间处理后主要香气成分的变化(μg/g)Table 3 Changes of main aroma components after different treatment time(μg/g)

2.4 不同发酵时间处理后主要香气成分的变化

表3为不同发酵时间下香气成分的变化情况，烟梗提取液经生香酵母发酵后香气成分在一定程度上得到提高。随着发酵时间的延长，总香气成分含量不断增加，发酵24h时，香气物质含量增加了97.21%;发酵36h，香气物质含量增加了109.32%;发酵48h后，香气成分总量增加了172.13%，为原含量的2.7倍。其中苯乙醇在整个发酵过程中增加显著，发酵48h后，增加了47.1倍。苯乙醇是烤烟的挥发油中最重要的致香化合物之一，可使烟气增加花香的香味［10］。

3 结论与讨论

3.1 生香酵母在烟梗提取液中生长，48h后进入衰亡期，为保证发酵质量，发酵时间不得超过48h。烟梗提取液经生香酵母发酵后，可溶性还原糖含量降低，而有机酸性成分含量增加，这种变化类似于在醇化过程中所经历的化学变化趋势［11］。

3.2 可溶性糖含量降低，其中以葡萄糖含量降低为主，果糖、蔗糖、麦芽糖等含量变化不大，表示生香酵母在发酵烟梗提取液时，以葡萄糖为主要的碳源。但葡萄糖降低将对烟气产生不利影响，因此在后续的应用中需补加葡萄糖。在整个发酵过程中，有机酸含量增高，特别是非挥发性有机酸含量显著增高，从而使提取液酸值升高，非挥发性有机酸对卷烟抽吸质量有重要作用，它们能与生物碱结合成盐，调节质子化和游离态烟碱比例，调节烟气pH，使烟气平和，吸味改进，浓度增加。烟梗提取液经生香酵母发酵后香气成分总量在一定程度上得到提高，较未发酵相比，发酵48h后总香气成分增加了172.13%，其中烤烟挥发油最重要的致香成分之一苯乙醇增加了47.1倍。

3.3 综上所述，生香酵母发酵烟梗提取液，能明显改善提取液的性质，这将有利于提高烟梗在制造烟草薄片中的价值，因为生香酵母的生长需要利用葡萄糖作为碳源，而葡萄糖对平衡烟气吸味具有积极作用，在下一步的研究中，需要研究葡萄糖的补加技术。

［1］D Layten Davis，Mark T，Nielsen 编著 .李天飞，译 .烟草－生产，化学和技术［M］.北京:化学工业出版社，2003:1－16.

［2］彭靖里，马敏象，吴绍情，等.论烟草废弃物的综合利用技术及其发展前景［J］.中国资源综合利用，2001(8):18－20.

［3］张岩磊.卷烟降焦工程［M］.北京:中国轻工业出版社，2000:150.

［4］许日鹏，苏文强，段继生.烟草薄片的开发与应用［J］.上海造纸，2008，39(6):46－49.

［5］Tamayo A I，Cancho F G.Microbiology of the fermentation of Spanish tobaccos［J］.International Congress of Microbiology，1953(6):48－50.

［6］English C F，Bell E J，Berter A J.Isolation of thermopiles from road leaf tobacco and effect of pure culture inoculation on cigar aroma and mildness［J］.Appl Microbio，1967，15:117－119.

［7］马林.利用生物技术改变烟叶化学组分提高其吸食品质和安全性的研究［J］.郑州工程学院学报，2001，22(3):40－42.

［8］沈轶，刘百战，王瑾，等.烟草中非挥发性有机酸及高级脂肪酸的快速分析方法［J］.上海烟草系统2004年度优秀学术论文集，2004:86－91.

［9］骆莉，卓浩廉，周瑢，等.生物技术及美拉德反应改良烟梗提取液的性质［J］.食品工业科技，2012，33(6):189－192.

［10］赵铭钦.卷烟调香学［M］.北京:科学出版社，2008:77.

［11］张悠金，金闻博.烟用香料香精［M］.合肥:中国科技大学出版社，1996:229.