高保真泡青菜卤微生物增殖培养条件的初步研究

贾 春，车振明，林洪斌，张 琦，廖 余

(西华大学生物工程学院，四川成都610039)

泡菜，味美、爽口、开胃、营养丰富且百吃不厌［1］，其生产加工主要采用传统自然发酵，此发酵方式存在生产周期长、产品品质稳定性差、安全性难以控制等问题［2－3］，严重制约了泡菜工业的发展。为使我国泡菜产业达到工业化、现代化、标准化，国内已进行了很多关于接种发酵的研究。杨晓辉［4］筛选出四株产酸好的菌株，将其接种发酵白菜，风味以及产酸速度明显优于自然发酵。余文华［5］等人研究了直投式菌剂在发酵不同泡菜品种时，泡菜各项理化指标的动态变化，认为直投式菌剂发酵有利于提高泡菜的品质和食用安全性。袁亚［6］等人研究认为植物乳杆菌和干酪乳杆菌混合发酵泡菜可明显缩短发酵时间、提高泡菜品质、降低亚硝酸盐含量。然而，泡菜发酵是由多种微生物共同作用而成，仅仅依靠单一菌种或复合菌种进行接种发酵，始终难以还原泡菜原有风味。基于此，本文通过改变和控制泡青菜卤微生物培养温度及培养基初始pH，对微生物菌群分布状况进行调节，研究不同培养条件下泡青菜卤微生物接种发酵泡菜过程中总酸、pH、氨基态氮、总糖和亚硝酸盐含量的变化，间接的研究高保真泡青菜卤微生物培养的最适pH和培养温度，以期达到对产品质量、风味以及营养价值改善和提高的目的，增加经济效益。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

陈泡菜卤 成都新繁食品有限公司;胡萝卜、食盐 市售;甲醛溶液、硫酸、亚铁氰化钾、乙酸锌、冰醋酸，硼酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、亚硝酸钠、氢氧化钠、盐酸 均为分析纯，成都科龙化工试剂厂;蒽酮 分析纯，上海化工试剂采购供应五联化工厂。

DHP－9052型电热恒温隔水式培养箱 上海益恒实验仪器有限公司;LDZX－75KB立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;UV－2600型紫外可见分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司;SW－CJ－2F型双人双面净化工作台 苏州净化设备有限公司;TDL－40B型台式低速大容量离心机 湖南星科科学仪器有限公司;PHS－3C型酸度计 方舟科技有限公司;JJ－2型组织捣碎机 江苏金坛市金城国胜实验仪器厂;78－1型磁力加热搅拌器 金坛市富华仪器有限公司;分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的制备［7］胡萝卜汁培养基制备工艺:胡萝卜→洗净→去皮及根梢→称重→切片→煮沸(料∶水=1∶4)100℃，5min→榨汁→离心(3000r/min，20min)→调 pH→121℃，15min灭菌备用。

1.2.2 菌种的制备

1.2.2.1 培养基起始pH对泡青菜卤中微生物接种发酵泡菜的影响 将泡青菜卤接种于pH分别为4、5、6、7、8的胡萝卜汁培养基中，每100mL胡萝卜汁接种8mL泡青菜卤。在恒温培养箱中培养20h后，混匀，取40mL培养液于离心管中，3000r/min离心20min，弃掉上清液，即得所需的菌种。

1.2.2.2 培养温度对泡青菜卤中微生物接种发酵泡菜的影响 将泡青菜卤接种于一定pH的胡萝卜汁培养基中，每100mL胡萝卜汁接种8mL泡青菜卤。分别在 15、20、25、30、35℃的恒温培养箱中培养 20h后，混匀，取40mL培养液于离心管中，3000r/min离心20min，弃掉上清液，即得所需的菌种。

1.2.3 泡青菜发酵工艺流程 采用高盐泡制(12.5%食盐浓度)和低盐发酵(7%食盐浓度)相结合，按下面工艺进行泡菜的恒温发酵。发酵温度为25℃。其工艺流程如下:

1.2.4 操作要点 选用细嫩、无病虫害的新鲜青菜为泡制原料，去掉黄叶、烂叶，并用清水洗净泥沙，并将其切分，沥干备用。首先将切分后的青菜在12.5%的食盐水中泡制3d，利用高浓度食盐水抑制或杀死残留在青菜上的微生物，并使青菜脱水入味，然后将泡青菜取出沥干，分装入坛，接种并浸泡在7%的食盐水中，25℃恒温发酵。注意装坛完成后，要用一定浓度的盐水将坛盖檐密封，保证泡菜坛内处于厌氧环境。

1.2.5 测定方法 泡青菜卤pH测定:采用数字pH计，分别用pH为4.00、6.86、9.18的标准缓冲溶液校准;泡青菜总酸的测定:采用酸碱滴定法［8］，NaOH浓度为0.09419mol/L;泡青菜氨基态氮的测定:采用甲醛滴定法［9］;泡青菜总糖含量的测定:采用蒽酮比色法［9］;泡青菜亚硝酸盐含量测定:采用分光光度法［10］。各项指标均为隔周测定，指标测定过程中严格保持泡菜发酵条件，避免不利影响。

2 结果与分析

2.1 不同起始pH对泡青菜卤微生物接种发酵泡菜理化指标的影响

2.1.1 泡菜总酸含量和泡菜卤pH的动态变化 泡青菜卤微生物培养基起始pH分别为4、5、6、7、8时，其接种发酵泡菜过程中总酸含量和泡菜卤pH的动态变化如图1～图2所示。

图1 培养基起始pH与泡菜总酸含量的关系Fig.1 The relationship between pickle total acid content and initial pH of medium

图2 培养基起始pH与泡菜卤pH的关系Fig.2 The relationship between pickle－brine pH and initial pH of medium

由图1、图2可知，不同培养基起始pH条件下培养的泡青菜卤微生物接种发酵的泡菜在发酵过程中总酸含量均呈现逐渐升高的趋势，在发酵第二周时，渐趋平衡。第四周时，培养基起始pH为7时的泡菜总酸含量持续上升而未达到平衡，有可能是因为该条件下培养的泡青菜卤中有害微生物繁殖过多，导致其接种发酵的泡菜在发酵贮藏后期变质而产生这一现象。发酵第2周时，总酸含量从高到低依次为培养基起始pH4、8、5、6、7。各泡菜卤 pH 逐渐降低，同样在第二周达到稳定，pH从高到低依次为培养基起始 pH6、7、8、5、4，此时泡菜发酵成熟，因此后面各指标的判定皆以发酵第二周的数据为依据。泡菜发酵初期的乳酸生成量不高，泡菜的总酸含量和泡菜卤pH变化幅度较小。随着乳酸的积累，泡菜进入发酵旺盛期。此阶段总酸含量迅速上升，泡菜卤pH降低速度较快，一直持续到第二周，总酸含量达3.5～5.0g/kg，泡菜酸味强烈。此后，随着总酸含量持续积累而进入发酵末期，此阶段泡菜的总酸含量缓慢增长，泡菜卤pH变化趋于平衡。

2.1.2 泡菜氨基态氮含量的动态变化 泡青菜卤菌种培养基起始 pH 分别为4、5、6、7、8时，其接种发酵泡菜过程中氨基态氮含量的动态变化如图3所示。

由图3可知，不同培养基起始pH条件下培养的微生物接种发酵的泡菜氨基态氮含量变化趋势基本一致(pH8除外)，均随着发酵时间的延长而先降低后升高。这是因为在泡菜发酵过程中，青菜中的蛋白质会被泡菜中微生物分泌的蛋白酶作用而不断降解成多肽、氨基酸等，这类物质会不断地溶入泡菜卤中，并被微生物利用，因此泡菜中氨基态氮含量逐渐降低［11］。但是当起始pH为8时，发酵第三周后氨基态氮含量的变化趋势则与其他四组相反。可能在泡菜发酵成熟后泡菜水中的氨基态氮会通过渗透作用进入泡菜［11］，而该条件下的这种现象出现较早所致。发酵第二周时，泡菜中氨基态氮含量从高到低依次为培养基起始 pH7、5、6、8、4。

图3 培养基起始pH与泡菜氨基酸态氮含量的关系Fig.3 The relationship between pickle amino nitrogen and initial pH of medium

2.1.3 泡菜总糖含量的动态变化 泡青菜卤微生物培养基起始 pH 分别为4、5、6、7、8时，其接种发酵泡菜过程中总糖含量的动态变化，如图4所示。

图4 培养基起始pH与泡菜总糖含量的关系Fig.4 The relationship between pickle total sugar and initial pH of medium

由图4可知，不同培养基起始pH条件下培养的微生物接种发酵的泡菜中总糖含量变化趋势基本一致，均随着发酵时间的延长而先降低后升高再降低。

这是因为，在泡菜发酵过程中，青菜中的糖类物质作为碳源被微生物分解利用，因此泡菜中总糖含量降低［11］。发酵第二周时，泡菜中总糖含量从高到低依次为培养基起始 pH4、7、6、5、8。

2.1.4 泡菜亚硝酸盐含量的动态变化 泡青菜卤微生物培养基起始pH分别为4、5、6、7、8时，其接种发酵泡菜过程中亚硝酸盐含量的动态变化，如图5所示。

图5 培养基起始pH与泡菜亚硝酸盐含量的关系Fig.5 The relationship between pickle nirite and initial pH of medium

由图5可知，不同培养基起始pH条件下泡菜中亚硝酸盐含量均呈降低的趋势。这是因为在泡菜发酵过程中，蔬菜表面以及卤水中有害微生物中硝酸还原酶将本来存在于蔬菜中的硝酸盐还原，因而亚硝酸盐含量增加。随着发酵的进行，泡菜中乳酸菌产酸使得pH降低，抑制了有害微生物硝酸还原酶的活性，使得亚硝酸盐含量降低。但是在泡菜发酵贮藏后期，培养基起始pH为4、7、8时的泡菜有可能因有害微生物的繁殖导致泡菜变质，亚硝酸盐含量升高。发酵第二周时，泡菜中亚硝酸盐含量从高到低依次为培养基起始 pH7、8、5、6、4。

2.2 不同培养温度对泡青菜微生物接种发酵泡菜理化指标的影响

2.2.1 泡菜总酸含量和泡菜卤pH的动态变化 泡青菜卤微生物培养温度分别为 15、20、25、30、35℃时，其接种发酵泡青菜过程中总酸含量和泡菜卤pH的动态变化如图6～图7所示。

图6 泡青菜卤微生物培养温度与泡菜总酸含量的关系Fig.6 The relationship between pickle total acid content and incubation temperature

图7 泡青菜卤微生物培养温度与泡菜卤pH的关系Fig.7 The relationship between pickle－brine pH and incubation temperature

由图6～图7可知，各温度下培养的泡青菜卤微生物接种发酵的泡菜在发酵过程中总酸含量均呈现逐渐升高的趋势，在发酵第二周时，逐渐趋于平衡，总酸含量从高到低依次为培养温度25、30、15、35、20℃。同时，各泡菜卤pH则逐渐降低，同样在第二周达到稳定，各条件下pH基本相同。

2.2.2 泡菜氨基态氮含量的动态变化 泡青菜卤微生物培养温度分别为 15、20、25、30、35℃时，其接种发酵泡菜过程中氨基态氮含量的动态变化如图8所示。

由图8可知，各温度下培养的微生物接种发酵的泡菜氨基态氮含量变化趋势基本一致，均随着发酵时间的延长而先升高后降低。当培养温度为20、30℃时，青菜中的蛋白质可被较快分解而使发酵过程中氨基态氮含量较其他几组稳定。发酵第二周时，泡菜中氨基态氮含量从高到低依次为培养温度25、30、15、20、35℃。

图8 泡青菜卤微生物培养温度与泡菜氨基态氮含量的关系Fig.8 The relationship between pickle amino nitrogen and incubation temperature

2.2.3 泡菜总糖含量的动态变化 青菜卤微生物培养温度分别为 15、20、25、30、35℃ 时，其接种发酵泡菜过程中总糖含量的动态变化如图9所示。

图9 泡青菜卤微生物培养温度与泡菜总糖含量的关系Fig.9 The relationship between pickle total sugar and incubation temperature

由图9可知，各温度下培养的微生物接种发酵的泡菜中总糖含量变化差别较大，其中当培养温度为25、30℃时，泡菜总糖含量基本保持稳定，而其他条件下泡菜总糖含量则有较大波动。发酵第二周时，泡菜中总糖含量从高到低依次为培养温度15、25、30、35、20℃。

2.2.4 泡菜亚硝酸盐含量的动态变化 泡青菜卤微生物培养温度分别为 15、20、25、30、35℃时，其接种发酵泡菜过程中亚硝酸盐含量的动态变化如图10所示。

图10 泡青菜卤微生物培养温度与泡菜亚硝酸盐含量的关系Fig.10 The relationship between pickle nitrite and incubation temperature

由图10可知，泡菜中亚硝酸盐含量先增加后降低，其动态变化存在“亚硝峰”，其中当泡青菜卤中微生物培养温度为15、25、35℃时的“亚硝峰”出现在第二周左右;当泡青菜卤中微生物培养温度为20℃时的“亚硝峰”出现时间较早，约在第一周即出现;泡青菜卤中微生物培养温度为30℃时的“亚硝峰”出现时间稍晚，大概在第三周左右出现。发酵第二周时，泡菜中亚硝酸盐含量从高到低依次为培养温度35、15、20、25、30℃。

3 结论

泡菜是蔬菜发酵制品的重要组成部分，随着我国食品发酵行业的不断发展，新型泡菜研制工艺是必趋之势，秉承现代生物技术在食品加工业的应用先例，由单一菌种接种发酵转向高保真菌种接种发酵新型泡菜加工技术的研究必将为发酵食品加工业翻开新的篇章。

本文通过研究不同培养基起始pH、培养温度对泡青菜卤微生物接种发酵泡菜过程中总酸、pH、氨基态氮、总糖和亚硝酸盐含量的影响，间接的研究高保真泡青菜卤微生物培养的最适pH和培养温度，结果表明:当培养基起始pH为5～6、泡青菜卤中微生物培养温度为20～25℃时，可提高泡青菜总酸含量、氨基态氮含量，降低泡青菜卤pH、总糖及亚硝酸盐含量。但是，本文仅限于对泡青菜发酵过程中的各理化指标进行测定，该成果虽然对新型发酵工艺的研制有一定的理论意义，但是培养基起始pH及培养温度对泡青菜卤微生物培养过程中微生物菌系之间的调节作用;接种发酵的泡菜中微生物分布状况;各条件下培养的泡青菜卤微生物对于接种发酵泡菜理化指标变化情况影响的原因等问题还需要进一步深入的研究和探讨。

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