吡哌酸有关物质检查方法的研究*

顾 云，曹晓云

(天津市药品检验所，天津 300070)

吡哌酸为广谱合成药物，可切断DNA链，主要作用于细菌细胞的DNA旋转酶(gyrase)，干扰DNA的合成而使细菌死亡，对包括绿脓杆菌在内的所有革兰阴性杆菌均有效，并对部分革兰阳性菌如金黄色葡萄球菌也有效。吡哌酸与抗生素之间没有交叉耐药性;而且与庆大霉素、羧苄青霉素有协同作用。为更好地控制质量，本试验采用HPLC法测定吡哌酸有关物质，该方法专属性强、灵敏度高、准确度和重复性好，方法简便，可作为吡哌酸的有关物质的检测方法。

1 仪器与试药

LC-2010 cLass-vp型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，AG245型电子天平，PB-10型精密 pH计(塞多利斯公司)，恒温干燥箱DN64(日本Uamato)，紫外线杀菌车DZS3型(上海科凌医疗器械有限公司)。吡哌酸供试品(山东新华制药股份有限公司提供，批号081195、081196、081197)，吡哌酸对照品(山东新华制药股份有限公司提供，批号20080512)。乙腈、甲醇为色谱纯，水为净化水，枸橼酸、癸烷磺酸钠及其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性 色谱柱：XDS-C18(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相：枸橼酸癸烷磺酸钠溶液(取枸橼酸5.7 g、癸烷磺酸钠1.7 g，加水溶解并稀释至1 000 ml)-乙腈 -甲醇(60∶20∶20);流速：1 ml/min，检测波长：275 nm，柱温：30 ℃，进样量：20 μl，监测器：紫外检测器(UV)。

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品溶液 取本品适量，用流动相溶解并定量稀释制成每1 ml中约含0.3 mg的溶液，作为供试品溶液。

2.2.2 对照溶液 精密量取供试品溶液适量，加流动相定量稀释制成每1 ml中含0.6 μg的溶液，作为对照溶液。

2.3 系统适用性试验 取吡哌酸适量，加流动相制成0.3 mg/ml的溶液，在紫外灯下(254 nm)光照2 h，混匀，作为系统适用性测试溶液。吡哌酸主峰的保留时间约为18 min，杂质A和杂质B分别以相对保留时间约为0.8和1.2限定，两降解杂质含量分别约为0.3%和0.3%，与主峰的分离度分别不小于 5.0和 3.6，见图1。

图1 吡哌酸有关物质测定系统适用性试验的HPLC色谱图(XDB柱)

2.4 专属性试验 经以下条件破坏，试验结果表明，杂质峰之间、杂质与主峰之间均能分离良好，本方法专属性好，色谱图见图2。

图2 酸破坏产物(A)碱破坏产物(B)氧化破坏产物(C)热破坏产物(D)光照破坏产物(E)溶液紫外光照破坏产物(F)HPLC色谱图

2.4.1 酸破坏试验 取吡哌酸(批号081195)15 mg，置50 ml量瓶中，加浓盐酸1 ml，置100℃水浴中加热

30 min后，加碱中和，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液依法检查。

2.4.2 碱破坏试验 取吡哌酸(批号081195)15 mg，置50 ml量瓶中，加1 mol/L NaOH 溶液10 ml，置100℃水浴中加热1 h后，加酸中和，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液依法检查。

2.4.3 氧化破坏试验 取吡哌酸(批号081195)15 mg，置 50 ml量瓶中，加 H2O2(30%)溶液 1 ml，室温放置30 min后，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液依法检查。

2.4.4 热破坏试验 取吡哌酸(批号081195)15 mg，置50 ml量瓶中，置105℃干燥箱内加热2 h后，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液依法检查。

2.4.5 光照破坏试验 取吡哌酸(批号081195)15 mg，置50 ml量瓶中，于强光下(4 000±500)Lx照射24 h后，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液依法检查。

2.4.6 溶液紫外光照破坏试验 取吡哌酸(批号081195)15 mg，置50 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，于254 nm紫外光下照射2 h后，摇匀，滤过，取续滤液依法检查。

2.5 最小检出限 取吡哌酸适量，精密称定，用流动相溶解并制成每1 ml含0.6 μg的溶液(相当于供试品溶液的0.2%)，依次倍量稀释，依法测定，结果对照溶液浓度为0.013 μg/ml时，峰高为基线噪音的3～4倍，故最低检出浓度为0.013 μg/ml(相当于供试品溶液的0.04%)。

2.6 供试品溶液稳定性 供试品溶液(批号081195)，分别在1、2、4、6、18 和 24 h 时进样，测定峰面积，结果峰面积的RSD为0.15%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内比较稳定。

2.7 线性范围 取“2.2.2”项下的对照溶液，分别精密量取0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 和 30.0 ml，各置于100 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。依法测定，以峰面积与其浓度(μg/ml)进行线性回归，回归方程为：Y=198 466 X+540.43(r=1.000 0)。由此可见，吡哌酸浓度在 0.062 7 ～3.760 8 μg/ml范围内线性关系良好。

2.8 有关物质的检查 取“2.2.1”和“2.2.2”项下的供试品溶液和对照溶液，精密量取对照溶液10 μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10%，再精密量取供试品溶液10 μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。供试品溶液色谱图见图3。若显示杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.2倍(0.2%)，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积(1.0%)。三批样品最大单一杂质均为0.1%，杂质总量均为0.2%。结果均符合规定。

图3 吡哌有关物质的供试品HPLC色谱图

3 讨论

3.1 相关性 本方法进行了相关性考查试验，供试品溶液的浓度在0.1～0.5 m/ml范围内，溶液的浓度与有关物质含量有良好的相关性。

3.2 粗放度 本方法采用不同型号色谱柱［XDBC18(150 mm × 4.6 mm，5 μm)、TSK ODS-80 S(150 mm ×4.6 mm，5 μm)、TC-C18(150 mm × 4.6 mm，5 μm)］测定同批样品(批号081195)有关物质，测定结果基本一致，本方法耐用性良好，可以作为控制吡哌酸质量的有效手段。

3.3 适用性试验 EP 6.0/BP2008以对羟基苯甲酸乙酯与吡哌酸混合溶液进行系统适用性试验，要求两者分离度应不低于4.0，测试结果，两者保留时间分别为11.1 和16.9 min，两峰相距较远，分离度为10.8，且供试品在对羟基苯甲酸乙酯出峰处无杂质。曾试验以对羟基苯甲酸乙酯和多种沙星类同系物作为分离度对照物峰，效果均不理想。本方法的系统适用性试验，是经不同条件的破坏实验，从中筛选出以紫外灯下(254 nm)光照2 h的供试品溶液作为分离度测试溶液。吡哌酸主峰的保留时间约18 min，杂质A和杂质B分别以相对保留时间约为0.8和1.2限定，两降解杂质含量分别约为0.3%和0.3%，与主峰的分离度分别不小于 4.5 和3.5。

本方法采用高效液相色谱法取代以往薄层色谱法来测定有关物质，其结果可靠，经方法学验证，此方法专属性强、灵敏度高、准确度和重复性好，可作为吡哌酸的有关物质的检测方法。