人参皂苷Rg1对局灶性脑缺血大鼠iNOS和eNOS表达的影响

邹晓莉，杜继卫，梁 佳，魏 嘉，包翠芬

(辽宁医学院科学实验中心，辽宁锦州121001)

缺血性脑病是指由于各种原因导致的脑血管堵塞，引起脑功能障碍的相应症状，严重危害人类健康。目前，该病的主要治疗原则为扩张血管、恢复正常血液供应、缩小梗死面积、改善血管内皮细胞、抗动脉硬化等，而一氧化氮(NO)在维持脑血管张力和调节血压方面起重要作用，其生成依赖于一氧化氮合酶(NOS)。2010年9月～2011年3月，本研究通过观察大鼠局灶性脑缺血后脑组织诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、内皮细胞型一氧化氮合酶(eNOS)的表达变化及人参皂苷Rg1对它的作用，探讨Rg1治疗脑缺血损伤的机制，为防治缺血性脑病的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠60只，体质量250～300 g，本实验室提供。药品及试剂:人参皂苷Rg1，纯度＞95%(吉林大学有机化学教研室提供);尼莫地平注射液(批号为071001，山西亚宝药业);兔抗大鼠iNOS、eNOS单克隆抗体(SANTA CRUZ公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠局灶性脑缺血模型的制备及分组10%水合氯醛腹腔麻醉，采用改良线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型［1］。线栓采用直径0.23 mm鱼线，长度由颈外动脉分叉处计约18.5 mm，假手术组插入深度小于15 mm。栓塞时间2 h。动物清醒后参照Zea Longa的5分制评分标准，采用单盲法进行神经功能缺损程度判定。对不符合条件的大鼠予以剔除。对于实验中剔除的大鼠均按严格的实验条件统一补充、分组。将SD大鼠随机分为6组各10只:假手术组、单纯缺血组、人参皂苷 Rg1 10、20、40 mg·kg－1处理组(Rg1 低、中、高剂量组)、尼莫地平1 mg·kg－1阳性药物处理组(control组)，每组10只。Rg1各组分别于术前5 d至取材前1 h腹腔注射人参皂苷Rg1，control组注射尼莫地平，其余各组分别注射等量生理盐水，1次/d。

1.2.2 免疫组织化学法检测iNOS、eNOS及图像分析 缺血2 h后，各组大鼠10%水合氯醛麻醉，灌流固定，断头取脑，常规石蜡包埋。石蜡切片脱蜡至水，免疫组化二步法染色。iNOS和eNOS阳性表达为细胞质呈棕黄色。采用CIAS-1000图像分析系统检测每高倍视野iNOS、eNOS的阳性表达情况。

1.3 统计学方法 采用SPSS10.0软件，数据均用¯x±s表示，多组间差异显著性检验采用单因素方差分析。P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

6组大鼠神经功能缺损评分及大脑皮层iNOS、eNOS表达阳性细胞数比较见表1。

3 讨论

NO是一种新型生物信使分子，广泛分布于生物体内各组织中，特别是神经组织中。NO是一种极不稳定的生物自由基，分子量小，可快速透过血脑屏障扩散;当血管压力突然升高时，NO可维持脑血流量相对稳定，同时降低全身平均动脉血压，控制全身各种血管床的静息张力，增加局部脑血流量，是血压及脑血管张力的主要调节因子。研究表明，脑短暂缺血后NO含量显著升高，但缺血3 h后下降，提示NO在局灶性脑缺血过程早期起重要作用［2］。NO的生成主要依赖于NOS。NOS有三个亚型，即神经型(NOS1)、iNOS和eNOS。研究表明，正常情况下NOS的活性很低，但脑短暂缺血后iNOS表达显著增多，eNOS无明显改变。

表1 大鼠神经功能缺损评分及大脑皮层iNOS、eNOS阳性细胞数(¯x ±s)

人参皂苷Rg1是人参的主要活性成分之一，具有抗氧化、清除自由基等脑保护作用，但是其作用机制还不甚清楚［3，4］。研究人员采用 Griess法、3HL精氨酸转化法分别研究大鼠大脑皮层细胞NO含量及NOS活性，结果显示Rg1可显著减少老年鼠大脑皮层NO含量和降低NOS活性。提示Rg1的抗衰老作用与其对NOS活性的抑制有关［5］。研究人员还发现，采用多巴胺诱导的PC12细胞凋亡用以模拟阿尔茨海默病，细胞NO代谢产物水平显著上升，预先应用不同浓度的人参皂苷Rg1进行处理，发现水平显著下降，并且浓度不同则调节效果不同，以浓度高组对含量的调节效果更为明显［6］;李玮等检测β淀粉样蛋白1-40诱导THP-1细胞上清中NO浓度和iNOS表达情况，结果显示Aβ模型组iNOS的表达明显高于对照组，应用人参皂苷处理后THP-1细胞iNOS的表达和NO的产生明显减少，随着人参皂苷剂量的增大，THP-1细胞iNOS的表达和NO的产生明显减少，且有剂量依赖性。提示人参皂苷可抑制THP-1细胞iNOS的表达，进一步影响 NO 的产生［7］。尚吉文等［8］采用全自动生化分析仪测定海绵体NO含量，结果发现去势组阴茎海绵体NO浓度较对照组显著降低，25 mg/kg人参皂苷组阴茎海绵体NO水平与去势组接近，100 mg/kg人参皂苷组NO水平较去势组明显升高，与对照组接近。提示人参皂苷可以提高去势大鼠阴茎海绵体组织NO水平，减少海绵体细胞凋亡，其对去势大鼠阴茎海绵体细胞凋亡的抑制作用可能与其增加NO水平有关。

本实验结果显示，假手术组无神经功能缺损，而神经元胞质内有少量的iNOS、eNOS阳性表达细胞;单纯缺血组大鼠则出现明显的神经功能缺损症状，神经元胞质内iNOS表达显著增多，而eNOS表达无明显改变;与单纯缺血组比较，人参皂苷Rg1处理组神经功能缺损症状得到显著改善，神经元iNOS阳性细胞数量显著减少，eNOS阳性细胞显著增多，以高剂量组改变最为显著，提示人参皂苷Rg1可能通过下调神经元iNOS、上调eNOS表达，调节NO水平，平衡脑血流量，维持血管张力，调节血压，从而减轻缺氧所致的脑损伤，发挥脑保护作用，但是iNOS、eNOS在改善脑缺血方面如何发挥作用还有待深入研究。

［1］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84-91.

［2］王蕾，徐建兴.脑缺血再灌注大鼠脑线粒体NO的生成及NOS活性的改变［J］.中国病理生理杂志，2000，16(4):289-292.

［3］刘霞，包翠芬，秦书俭，等.人参皂苷Rg1对脑缺血-再灌注大鼠海马CA1区神经元的保护作用及机制［J］.解剖科学进展，2010，16(2):177-180.

［4］包翠芬，刘霞，秦书俭，等.人参皂甙Rg1对脑缺血再灌注大鼠脑组织Bax和Bcl-2蛋白表达的影响［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2009，18(2):217-221.

［5］李君庆，李宗锴，段红，等.年龄及人参皂甙 Rg1对大鼠大脑皮层 NO 释放的影响［J］.药学学报，1997，32(4):251-254.

［6］陈晓春，朱元贵，陈丽敏，等.一氧化氮诱导PC12细胞凋亡及人参皂苷Rg1的保护作用［J］.中国药理学通报，2002，18(5):516-519.

［7］李玮，李林，褚燕琦，等.人参皂甙对β淀粉样蛋白诱导THP-1单核细胞一氧化氮合酶和一氧化氮的影响［J］.中国神经免疫学和神经病学杂志，2006，18(2):94-97.

［8］尚吉文，王剑华，沈寅初，等.人参皂甙对去势大鼠阴茎海绵体组织NO含量与细胞凋亡的影响［J］.中国男科学杂志，2007，21(11):15-19.