阿托伐他汀对心肌梗死后大鼠主动脉平滑肌NADPH氧化酶的影响

高艳周，王小燕，李红霞，韩莲花，李 勋

(苏州大学附属第一医院，江苏苏州215006)

体内活性氧产生超过内源性抗氧化防御系统的清除能力时便发生氧化应激，研究表明氧化应激在动脉粥样硬化等血管性疾病的发生发展过程中起重要作用。近来发现NADPH氧化酶是心血管系统产生活性氧的主要来源［1］。他汀类药物除调脂作用外，尚具抗氧化作用，但其作用机制尚不十分清楚。2010年6月～2011年5月，本研究通过建立大鼠心肌梗死(心梗)模型，并予阿托伐他汀进行干预，测定主动脉平滑肌超氧阴离子()浓度及Nox1 mRNA和Nox4 mRNA表达，旨在探讨心梗后平滑肌NADPH氧化酶的变化及阿托伐他汀对其干预作用。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠由苏州大学动物实验中心提供，测定试剂盒购自江苏碧云天生物试剂公司，RT-PCR试剂盒购自美国Fer-mentas公司，引物购自上海生工技术服务有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立 取体质量230～260 g雄性SD大鼠，用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)行腹腔麻醉，开胸暴露心脏结扎左前降支为手术组，仅穿线而不结扎为假手术组，手术组大鼠于术后第二天随机给予10 mg/(kg·d)阿托伐他汀或等体积生理盐水灌胃5周，设为心梗干预组和心梗组。术后第6周共存活大鼠20只，其中假手术组6只，心梗组8只，心梗干预组6只;用10%水合氯醛麻醉并开胸取胸主动脉平滑肌。

1.2.3 Nox1 mRNA和Nox4 mRNA表达水平测定采用RT-PCR法。取大鼠主动脉平滑肌组织按Trizol试剂盒说明用三氯甲烷—异丙醇—乙醇一步法提取总RNA，260 nm紫外分光光度计定量。取2 μg总RNA按MMLV试剂盒逆转录说明书进行逆转录，cDNA作为PCR反应模板。Nox1引物序列为sense:5'-ATAGCTACTGCCCACCCCAAGT-3'，antisense:5'-TTGAGTACCGCCGACAGCA-3'(99 bp);Nox4引物序列为sense:5'-GAACCTCAACTGCAGCCTGATC-3'，antisense:5'-CTTTGTCAACAATCTTCTTGTTCTC-3'(111 bp);β-actin引物序列为 sense:5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'(241 bp)。antisense:5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3'。取5μL反应产物于1%琼脂糖凝胶电泳后经凝胶成像系统分析处理，以目的基因表达量与β-actin表达量比值作为Nox1和Nox4 mRNA的相对表达量。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件，计量资料以x¯±s表示，不同组间均数比较采用方差分析，两变量相关性采用线性相关分析。P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.2 各组平滑肌Nox1 mRNA及Nox4 mRNA表达的比较 心梗组Nox1 mRNA表达(0.68±0.05)显著高于假手术组(0.44±0.06)(P ＜0.01)和心梗干预组(0.46 ±0.05)(P ＜0.05)，心梗干预组与假手术组间比较无统计学差异(P＞0.05)。心梗组Nox4 mRNA表达(0.67±0.06)显著高于假手术组(0.46±0.08)(P ＜0.01)和心梗干预组(0.48 ±0.07)(P＜0.05)，心梗干预组与假手术组间比较无统计学差异(P＞0.05)。见图1。

图1 Nox1 mRNA和Nox4 mRNA表达的电泳图

3 讨论

随着生活节奏的加快及饮食结构的改变，急性心梗的发病率逐年上升，且呈现明显的年轻化趋势，而再灌注治疗的广泛开展使急性心梗患者的救治成功率明显提高，但心梗后由于心肌细胞丧失、血流动力学发生异常而使神经体液因素激活，机体发生氧化应激，最终导致心力衰竭的发生;此外，机体氧化应激也可以导致血管功能和结构改变，使血流动力学进一步恶化。故尽可能减少心肌坏死以保持心脏功能及应用药物抑制神经体液因素激活和氧化应激的发生成为当今急性心梗的主要治疗措施。

NADPH氧化酶包括Nox1-5和Duox1-2，统称为Nox家族，血管平滑肌则主要表达 Noxl和 Nox4［2］，称为血管细胞NADPH氧化酶。黄湘等［3］发现心梗患者血清蛋白氧化产物、丙二醛、超氧化物歧化酶和氧化型低密度脂蛋白水平较健康组明显升高，说明心梗后存在氧化应激。活性氧产生增多可诱导血管内皮细胞凋亡［4］、使NO灭活增加而致血管舒张功能下降、促进平滑肌细胞增殖［5］而致血管重构，最终导致外周血管阻力增加。本研究发现，心梗组O－浓度显著高于假手术组，进一步的研究发现

2 Nox1 mRNA和Nox4 mRNA表达增加，且表达水平与浓度升高相关，提示心梗后平滑肌Nox1 mRNA及Nox4 mRNA表达增加导致生成增加。Wingler等［6］研究发现，培养的大鼠主动脉平滑肌暴露于血管紧张素Ⅱ的时间愈长，Nox1 mRNA及Nox4 mRNA表达愈高。

他汀类药物具有药物多效性。本研究发现阿托伐他汀可通过抑制Nox1 mRNA及Nox4 mRNA表达而减少产生。Maack等［7］对心衰患者的研究发现阿托伐他汀可减少生成，表明阿托伐他汀可抑制氧化应激。另有研究提示，阿托伐他汀通过降低NADPH氧化酶的表达和活性［8，9］而减少生成。

［1］Babior BM，Lambeth JD，Nauseef W.The neutrophil NADPH oxidase［J］.Arch Biochem Biophys，2002，397(2):342-344.

［2］Tamara M，Paravicini，Lerna M，et al.Increased NADPH oxidase activity，gp91phox expression，and endothelium-dependent vasorelaxation during neointima formation［J］.Circ Res，2002，91(1):54-61.

［3］黄湘，谭家余，杨彩，等.老年急性心肌梗死与氧化应激的关系研究［J］.西北国防医学杂志，2009，30(5):334-336.

［4］ Pollman MJ，Hall JL，Gibbons GH.Determinants of vascular smooth muscle cell apoptosis after balloon angioplasty injury.Influence of redox state and cell phenotype［J］.Circ Res，1999，84(1):113-121.

［5］Alvarez A，Sanz MJ.Reactive oxygen species mediate angiotensinⅡ-induced leukocyte-endothelial cell interactions in vivo［J］.Leukoc Biol，2001，70(2):199-206.

［6］Wingler K，Wunsch S，Kreutz R，et al.Upregulation of the vascular NAD(P)H-oxidase isoforms Nox1 and Nox4 by the renin-angiotensin system in vitro and in vivo［J］.Free Radic Biol Med，2001，31(11):1456-1464.

［7］Maack C，Kartes T，Kilter H，et al.Oxygen free radical release in human failing myocardium is associated with increased activity of rac1-GTPase and represents a target for statin treatment［J］.Circulation，2003，108(13):1567-1574.

［8］Wang CY，Liu PY，Liao JK.Pleiotropic effects of statin therapy:molecular mechanisms and clinical results［J］.Trends Mol Med，2008，14(1):37-44.

［9］Cangemi R，Loffredo L，Carnevale R，et al.Early decrease of oxidative stress by atorvastatin in hypercholesterolaemic patients:effect on circulating vitamin E［J］.European Heart Journal，2008，29(1):54-62.