IL-10单核苷酸多态性与溃疡性结肠炎的相关性研究

李贞娟，张彩凤，韩 宇，文廷玉，董良鹏，张秀英

(新乡医学院第一附属医院，河南卫辉453100)

溃疡性结肠炎(UC)是一种发生于结直肠的慢性非特异性炎症性疾病，其病因可能与遗传易感人群在多因素作用下所引起的肠道黏膜免疫系统异常反应相关［1］。IL-10作为炎症抑制因子，能够抑制UC患者中Th1型细胞因子的分泌，在其发生发展过程中起重要作用。IL-10分泌量主要由遗传决定，而且主要受转录水平控制。研究表明，IL-10基因启动子区域主要有3个单核苷酸多态性(SNPs):IL-10－592(C→A)、IL-10－819(C→T)、IL-10－1082(G→A)，IL-10启动子区多态性位点与其在血清中的蛋白表达关系密切。本研究就IL-10启动子区IL-10－1082/－819/－592位点SNPs及其在 UC患者血清中表达的相关性进行探讨，为UC分子及基因水平的诊断、治疗、预后评估及相关研究奠定实验基础。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2008年5月～2010年8月于我院就诊的门诊及住院UC患者60例(UC组)，均符合全国炎症性肠病诊疗规范共识意见［2］。其中轻度24例、中—重度36例;年龄(43.30±11.60)岁。对照组40例，男22例、女18例，年龄(40.21±10.32)岁，均系我院健康体检者，均无血缘关系。两组年龄及性别均衡可比。

1.2 方法

1.2.1 血清IL-10的检测 应用ELISA法测定IL-10。患者于清晨空腹采肘静脉血3 mL，离心取血清，置－20℃保存待测。

1.2.2 IL-10基因型检测 采用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性法检测IL-10－592A/C、IL-10－1082 A/G基因型。收集UC组及对照组外周静脉血5 mL，应用EDTA-K2抗凝，加入红细胞裂解液裂解红细胞，离心去上清，重悬白细胞，再加入白细胞裂解液裂解白细胞，按照常规酚:氯仿:异戊醇抽提法提取基因组DNA，并用2%琼脂糖凝胶电泳检测后－80℃储存备用。IL-10－592A/C、IL-10－819 T/C、IL-10－1082A/G三个位点PCR扩增引物，由上海生工公司负责合成。三个位点均采用特异性引物扩增方法。引物序列见表1。IL-10－592A/C位点和IL-10－1082A/G位点扩增片段长度分别为412 bp、139 bp，PCR 的扩增体系为 25 μL，含0.5 U Taq酶，模板基因组 DNA(25 ng/μL)1 μL，10×PCR Buffer缓冲液2.5μL、10 pmol/L上游引物和下游引物各2 μL，MgCl2(2.5 mmol/L)1.5 μL，加水至总体积25μL。PCR反应条件为:94℃预变性5 min，95℃变性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸5 min。PCR反应后取10μL PCR反应产物，加入5 U限制性内切酶(RsaⅠ消化－592位点或MnlⅠ消化－1082位点)，37℃消化8 h。消化产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离后进行结果判读。RsaⅠ酶切为175、237 bp两个片段的是－592AA纯合型，不能切开的412 bp产物为－592CC纯合型，同时具有412、237、175 bp 3个片段的是－592杂合型。MnlⅠ酶切－1082(G/A)，G等位基因被切断，产生106和33 bp两个片段的是－1082GG纯合型，139 bp的是 －1082AA纯合型，产生139、106和33 bp 3个电泳条带的是－1082G/A杂合型。IL-10－819C/T扩增片段长度为402 bp。扩增反应条件为63℃退火30 s，其余条件同上。上游引物1与下游引物3扩增后在402 bp处出现电泳条带为等位基因TT纯合型，上游引物2与下游引物3扩增后在402 bp处出现电泳条带为等位基因CC纯合型。在两对引物扩增后402 bp处均存在电泳条带为CT杂合子。

表1 各基因位点引物序列

1.2.3 统计学方法 采用SPSS11.0统计软件，均数以¯x±s表示，比较采用T检验，率的比较采用χ2检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清IL-10的表达 IL-10在UC组(轻度、中—重度)及对照组血清中的表达分别为(17.3±1.4)、(10.8 ± 2.2)、(18.2 ± 2.6)ng/mL，轻度UC患者血清IL-10水平与对照组差异无统计学意义(P＞0.05)，中—重度UC患者血清IL-10水平较对照组显著降低(P＜0.05)。

2.2 两组IL-10三个位点SNPs的表达情况 －592和－819位点基因型高度连锁，即－592CC和－819CC、－592CA和 －819TC、－592AA和 －819TT总是同时出现。见表2。

表2 两组IL-10三个位点SNPs比较［例(%)］

3 讨论

多数学者认为IL-10的缺乏与UC的发生关系密切，IL-10是一种多效性细胞因子，具有抑制炎症与促进炎症的双重作用［3，4］，在UC的发生发展过程中起重要作用。

人类编码IL-10基因位于染色体lq31-32上，含有5个外显子和4个内含子，启动子区域有多个SNPs。目前对于IL-10基因启动子多态性的研究，大多数集中于－1082G/A、－819T/C和 －592A/C三个位点。文献报道，细胞因子SNPs可能与其在细胞因子转录功能不同有关［5，6］。IL-10是机体体液免疫和细胞免疫的重要成分。有研究发现，在体外，刺激不同个体的全血细胞，其产生IL-10的能力显著不同［7］，根源在于IL-10基因启动子的多态导致其mRNA合成率不同［8］。因此，个体表达 IL-10的能力主要取决于其遗传背景。新近研究发现，IL-10基因启动子区 －1082G/A、－819C/T、－592C/A位点的SNPs与IL-10基因的转录活性以及血浆中IL-10的水平有关。

本文对60例UC患者和40例健康人血清IL-10水平及IL-10三个位点的SNPs进行了研究，结果表明，UC中—重度患者血清中IL-10含量较健康人显著升高，而UC轻度患者血清中IL-10含量与健康人之间无统计学差异。IL-10有 －592、－819和 －1082三个 SNPs位点，IL-10－592位点和 IL-10－891位点AA型和AC型在UC组分布相同，且均高于对照组。UC组IL-10－592位点和IL-10－891位点CC型分布频率低于对照组，提示IL-10－592位点和IL-10－891位点C基因对UC的发病影响更大，且影响IL-10的表达。众多研究表明，IL-10－819位点与－592位点等位基因紧密连锁［9～11］。本研究也发现，IL-10启动子等位基因分布存在－592A等位基因与－819T等位基因总是同时出现，是高度连锁的。Turner等［12］研究表明，IL-10启动子区域的几个SNP与IL-10的分泌水平相关，转录起始位点处－1082G/A的替换改变了机体合成IL-10的能力，－1082与 IL-10的高产量相关，而 －1082A则与IL-10的低产量相关。本研究结果显示，IL-10－1082位点AA型在UC组较对照组表达明显增加，IL-10－1082位点GG型较对照组明显下降，二者在UC中变化趋势是截然相反的。提示IL-10－1082位点A基因和G基因均影响IL-10的表达，UC患者IL-10－1082位点A基因表达增加，IL-10－1082位点G基因表达下降，而UC患者血清中IL-10表达是下降的，与Turner等［12］研究相似。提示血清中IL-10的表达水平或IL-10启动子区的不同基因型可以反映UC的发病敏感性或活动度。

目前的研究表明，UC IL-10连锁基因及易感基因的多态性与其发病的易感性密切相关，但其机制尚未完全明了，仍待大样本、多民族、多人种的比较性研究进一步明确，从而更加全面地理解 IL-10 SNPs在UC发病中的作用。

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