p53异构体和MDM2、PTEN在胃癌组织中表达的相关性

孙 娜，季万胜，刘俊衡，刘丹丹，高志星

(潍坊医学院，山东潍坊261041)

胃癌是指起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，目前认为胃癌的发生发展是多环节、多因素、多基因相互作用的结果。p53抑癌基因功能的失活在胃癌的发生发展过程中起重要作用。但最近的统计数据表明，中国内地胃癌 p53的突变率为30.6%［1］，提示部分胃癌的发生并没有伴随着p53的高突变率。研究显示，p53的生物化学和生物学功能是可以通过p53异构体和全长p53蛋白之间的相互作用来调节的。因此，研究p53异构体在胃癌组织中的表达模式、异构体对野生型p53功能的影响、特别是对p53下游分子表达水平的影响，有可能发现胃癌发生的新机制。我们采用PCR、免疫组化方法检测了胃癌组织和癌旁胃组织中 p53异构体、双微基因2(MDM2)、同源性磷酸酶张力蛋白(PTEN)的表达情况，并探讨其在胃癌发生、发展中的作用及它们之间的相互关系，为胃癌的早期和临床诊断提供更多的新思路和新方法。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2009年11月～2011年2月于潍坊医学院附属医院普外科行胃癌根治术的30例胃癌患者的手术切除标本［包括胃癌组织和癌旁胃组织(距离正常胃癌组织5 cm)］。患者在术前均未接受任何放化疗。男21例、女9例，年龄40～82岁、平均56岁。所取肿瘤组织均经术后病理诊断为胃癌，所取癌旁胃组织均经病理诊断未检测到癌细胞。

1.2 方法

1.2.1 PCR法检测胃癌组织和癌旁胃组织中p53β、p53γ、Δ133p53、Δ133p53β、Δ133p53γ 的表达情况 应用UNIQ-10柱式Trizol总RNA提取试剂盒提取胃癌组织和癌旁胃组织的总RNA。胃组织RNA逆转录反应:按照MMLV第一链cDNA合成试剂盒说明书及相关文献操作，以试剂盒内的Oligo-p(dT)18Primer为随机引物，以M-MuLV RT酶为逆转录酶进行体外逆转录反应。胃组织中 p53β、p53γ、Δ133p53、Δ133p53β、Δ133p53γ 五种 p53 异构体PCR扩增。总RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒、PCR扩增试剂盒、引物购自Sangon上海生工，BIO-RAD MyCyder PCR仪购自美国伯乐公司。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后，将凝胶放入购自美国UVP的BioSpectrum AC凝胶成像系统扫描并拍照，并对电泳结果进行判定。

1.2.2 免疫组化PV-9000两步法检测胃癌、癌旁组织中MDM2和PTEN的表达情况 标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，常规HE染色，病理确诊，免疫组化步骤按说明书进行。鼠抗人MDM2和PTEN单克隆抗体均购自北京中杉金桥，均为3 mL工作液。以PBS代替一抗作阴性对照。每张切片随机选择5个视野，共计数100个肿瘤细胞，分别计算2种抗体的阳性细胞百分率。由2位以上病理医生对免疫组织化学染色进行评价，依据镜下切片中阳性染色细胞占瘤细胞总数的比例分为2级，－:无染色或染色阳性细胞数≤10%，+:染色阳性细胞数＞10%。

1.2.3 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件，数据以百分比表示，比较行χ2检验，应用Spearman’s等级相关进行相关性分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p53异构体在胃癌组织和癌旁胃组织中的表达 在30例胃癌组织和癌旁胃组织中均未检测到p53γ、Δ133p53β、Δ133p53γ 这三种异构体的 mRNA表达。Δ133p53的表达结果:在30例胃癌组织中有21例表达，占70.0%(21/30);在30例癌旁胃组织中有7例表达，占 23.3%(7/30);胃癌组织中Δ133p53表达高于癌旁胃组织(P ＜0.01)。p53β的表达结果:在30例胃癌组织中有8例表达，占26.7%(8/30);在30例癌旁胃组织中有21例表达，占70.0%(21/30)，胃癌组织p53β的表达低于癌旁胃组织(P ＜0.01)。

2.2 MDM2、PTEN在胃癌组织和癌旁胃组织中的表达 MDM2的表达结果:在30例胃癌组织中有19例表达，占63.3%(19/30);在30例癌旁胃组织中有7例表达，占23.3%(7/30)，MDM2在胃癌组织中表达高于癌旁胃组织(P＜0.01)。PTEN的表达结果:在30例胃癌组织中有16例表达，占53.3%(16/30);在30例癌旁胃组织中有26例表达，占86.7%(26/30)，胃癌组织PTEN的表达低于癌旁胃组织(P ＜0.01)。

2.3 p53异构体和MDM2、PTEN表达的相关性分析 Spearman’s相关性分析显示，Δ133p53和MDM2，p53β和PTEN在胃癌中表达呈正相关关系(r=0.408，P=0.025;r=0.413，P=0.023);Δ133p53和PTEN，p53β和MDM2在胃癌中表达呈负相关关系(r= －0.467，P=0.009;r= －0.480，P=0.007)。见表 1、2。

表1 胃癌组织中Δ133p53与MDM2、PTEN相关性分析

表2 胃癌组织中p53β与MDM2、PTEN相关性分析

3 讨论

抑癌基因p53的功能失活在胃癌的发生发展过程中起重要作用，p53异构体的发现为胃癌发生机制的研究提供了新方向。p53异构体的活性主要通过改变内部启动子的活性、p53 mRNA的剪接及p53异构体的亚细胞定位来实现［2］。最近研究发现，人类p53异构体(Δ133p53和p53β)能够组成一内源性的调节机制，并且能够作用于p53介导的复制细胞的衰老。在人类正常成纤维细胞中，p53β的诱导生成和Δ133p53的减少与复制细胞的衰老有关，这种衰老与癌基因所致的衰老不同。在结肠腺癌中可以观察到Δ133p53表达水平升高和p53β表达水平下降，这可能是在从腺瘤到癌的进展过程中，逃脱了衰老障碍的一种信号［3］，即天然存在的p53异构体为复制细胞的衰老进行生理学上的调节。随着体内试验证据表明，p53异构体特异性表达的建立和缺失能够分别诱导和逃脱衰老状态，如果打破这种衰老机制则可以诱导肿瘤的生成。本研究显示，在胃癌组织中发现Δ133p53 mRNA水平增高，p53βmRNA水平降低，与文献报道一致。

p53基因是人类发现最早的抑癌基因，MDM2高表达呈现癌基因的功能，其表达产物在细胞核内可以与野生型和突变型p53结合使其功能失活。p53和MDM2之间存在着自我反馈环，该反馈环使细胞内的MDM2/p53比率保持恒定［4］。通过研究p53-MDM2自我反馈环，发现MDM2与p53结合后可使p53泛素化，泛素化的p53被蛋白酶体降解而直接被清除［5，6］。正确的亚细胞定位对于p53的活性十分重要，p53被激活后进人核内，激活其靶基因的转录，之后回到胞质中被降解。最近发现，p53向核外转运可能以MDM2依赖性的方式进行控制，因为MDM2中含有的NLS和NES保证了MDM2可以穿梭于胞核与胞质之间，核内MDM2将p53捕获，通过MDM2上的NLS将两种蛋白质运出细胞核。如果细胞将MDM2修饰或改变核输出装置使MDM2滞留在核，p53将不被降解。PTEN是具有磷酸酶活性的抑癌基因，该基因的编码产物能够使被PI3K激活的细胞内第二信使PIP3去磷酸化，从而影响细胞内 PI3K/Akt信号转导途径［7，8］。MDM2 是一原癌基因，最近研究表明，PI3K/Akt信号转导途径可以激活细胞的磷酸化过程，从而导致MDM2癌蛋白由胞质进入胞核，而PTEN可以通过对该信号转导途径的影响，阻止MDM2癌蛋白由胞质进入胞核，从而加速该蛋白的降解［7，9］。由此PTEN 参与到p53-MDM2自我反馈环中，形成了PTEN-MDM2-p53网络环路，影响着肿瘤的生成。

本研究结果显示，在胃癌组织和癌旁胃组织中p53异构体的表达情况不同，能够检测到Δ133p53、p53β 表达，未检测到 p53γ、Δ133p53β、Δ133p53γ 的表达。Δ133p53、MDM2在胃癌组织中的表达高于癌旁胃组织，p53β、PTEN在癌旁胃组织中的表达高于胃癌组织。相关性分析显示，Δ133p53和MDM2，p53β和 PTEN在胃癌中的表达均呈正相关;Δ133p53和PTEN，p53β和MDM2在胃癌中的表达均呈负相关。由此推测，在胃癌的发生、发展过程中，Δ133p53、p53β通过调节 p53活性，并以 p53为中介，影响了PTEN-MDM2-p53网络环路中PTEN、MDM2蛋白的表达，并提示 p53异构体中的Δ133p53可能是通过降低PTEN、p53的抑癌蛋白表达及提高MDM2促癌蛋白的表达而发挥促癌作用的;而p53β可能是通过提高PTEN、p53的抑癌蛋白表达及降低MDM2促癌蛋白的表达，调控PTENMDM2-p53网络环路从而促进胃癌的发生。

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