龙血素B对肝星状细胞增殖及细胞外基质分泌的影响

李玉莲，范 红，宋正己，彭 伟，陈艳敏，高建梅(昆明医学院附属昆华医院，云南昆明650032)

肝星状细胞(HSC)在肝脏受到炎症或机械刺激时被激活，其激活是肝纤维化和最终肝硬化发生的中心事件［1］;抑制 HSC激活、增生，或促进激活的HSC凋亡是治疗肝纤维化的重要途径。2010年9～2011年6月，本实验应用HSC-T6细胞系，观察龙血素B对HSC增殖及细胞外基质分泌的影响，以探索临床抗肝纤维化的新途径。

1 材料与方法

1.1 材料 实验细胞与药物:HSC-T6细胞系，购于中国科学院昆明细胞库;龙血素B中药化学对照品，购于中国药品生物制品检定所(用甲醇配成10 μg/μL的原液，临用时加入含 10%小牛血清的DMEM高糖培养液，并稀释为所需浓度)。主要试剂及仪器:DMEM高糖培养液、PBS缓冲液均购自北京海克隆;新西兰新生牛血清购于美国Gibco公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)购于sigma公司;青霉素—链霉素溶液、0.25%胰蛋白酶溶液均购自Bioind公司;二甲基亚砜(DMSO)为上海生工生物工程公司Amresco进口分装。SW-CJ-2F标准型净化工作台;倒置显微镜(Olympus，BX60);美国Thermo Scientific Forma seriesⅡ水套CO2培养箱;XK96-Ⅰ型微量振荡器;Model∑960型酶标仪。

1.2 方法

1.2.1 MTT法检测HSC的增殖情况 HSC-T6细胞37℃复苏，用含10%小牛血清的DMEM高糖培养液，置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内培养，至少传代培养一代后，将处于对数生长期的HSC配成1×105/mL细胞悬液，接种于96孔板，每孔100 μL。将培养的HSC分为3组，空白对照组:培养孔中为培养基，作为实验调零孔;细胞对照组:细胞加含血清培养液;龙血素B作用组:细胞加含不同浓度龙血素B液的培养液，24 h后将不同浓度的药物(设0.500、0.400、0.200、0.100、0.050、0.025 μg/μL 6个药物终浓度)加入培养孔，每孔100μL，各浓度均设5个复孔。对照孔均加入100μL含10%小牛血清的培养液。48 h后每孔加0.5%MTT贮存液20 μL，继续孵育4 h后弃上清，每孔加入DMSO 150μL溶解细胞内结晶，微型振荡器振荡10 min，用全自动酶标仪在490 nm波长处采用比色法测定各孔OD值，测得的各复孔OD值取平均数。抑制率(IE)=(对照孔 OD490－实验孔 OD490/对照孔 OD490×100%)。观察药物对细胞生长的影响，并计算药物的半数抑制量(IC50)，以IC50为高剂量处理细胞。

1.2.2 放射免疫法检测透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)和Ⅳ型胶原(Ⅳ-C) 将HSC-T6稀释成1.5×105/mL细胞悬液接种于24孔板，每孔1 mL，至细胞长至近单层后，加入含不同浓度龙血素B(0、0.030、0.150、0.300 μg/μL) 的培养液，每孔 200 μL，培养48 h，取上清液用放射免疫法分别检测HA、LN 和Ⅳ-C。

1.2.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件，计量资料以¯x±s表示，比较采用单因素变量的方差分析和最小差值显著法(LSD-t)。P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 不同浓度龙血素B对HSC增殖的抑制作用

不同浓度龙血素B处理48 h后，HSC生长受到抑制，在0.025 ～0.500 μg/μL 的浓度范围，抑制率随浓度升高而升高。见表1。

2.2 龙血素B对HSC分泌HA、LN和Ⅳ-C的影响

龙血素B处理细胞后可不同程度抑制HSC分泌HA、LN 和Ⅳ-C，尤以0.300 μg/μL龙血素B 效果最佳。见表2。

3 讨论

血竭为棕榈科植物，又名麒麟竭，由果实渗出的树脂经加工制成，为传统名贵中药。我国国家标准［WS3-082(Z-016)-99(Z)］中将百合科龙血树属植物剑叶龙血树Dranaena cochinchinensis(Lour.)S.C.Chen的含树脂木材经提取得到的树脂定名为“龙血竭”，其具有活血、化瘀、止血、补血的功效，被誉为“活血圣药”［2］，龙血素 B(C18H20O5)是龙血竭的主要有效成分，前期试验表明，龙血竭除了能有效地减轻肺纤维化大鼠肺组织的纤维化程度［3］外，其主要成分龙血素B还能对硫代乙酰胺诱导的大鼠肝纤维化有一定的预防和治疗作用［4］。

表1 不同浓度龙血素B对HSC增殖的抑制作用(n=5，¯x ±s)

表2 龙血素B对HSC分泌HA、LN和Ⅳ-C的影响(¯x ± s)

HSC激活是肝纤维化发生、发展的中心环节和共同通路。HSC在慢性肝损伤时被激活，并同时分泌多种细胞因子促进自身的活化。在HSC激活的持续阶段，细胞外基质(ECM)重建继续进行，ECM合成增加而降解减少，并逐渐被富含纤维的胶原所替代，纤维化进一步加重。抑制HSC的激活或促进激活的HSC凋亡有望成为抗肝纤维化的新途径。本实验体外研究显示，经龙血素B处理48 h后，HSC 生长受到抑制，在 0.025～0.500 μg/μL 的浓度范围，抑制率随浓度升高而升高。说明龙血素B可剂量依赖性地抑制HSC的增殖。

HA为基质成分之一，由间质细胞合成，是反映肝损害严重程度、判断有无活动性肝纤维化的定量指标，可较准确灵敏地反映肝内已生成的纤维量及肝细胞受损状况。Ⅳ-C是构成基底膜的主要成分，在肝纤维化时出现最早，合成和降解都处于较高水平，反映基底膜胶原更新率，其含量增高可较灵敏反映出肝纤维化过程，是肝纤维化的早期标志之一。LN为基底膜中特有的非胶原性结构蛋白，可以反映肝纤维化的进展与严重程度，与肝纤维化活动程度及门静脉压力呈正相关。血清HA、Ⅳ-C、LN联合检测可对肝纤维化程度的判定、肝硬化的早期诊断具有一定的临床意义，是判断肝纤维化的敏感可靠指标［5］。本实验结果显示，龙血素B能不同程度地降低HSC细胞上清中HA、LN、Ⅳ-C的含量。

综上所述，龙血素B可抑制HSC活化及增殖，并抑制ECM的合成、促进其降解，对肝纤维化有一定的防治作用。

［1］Guo J，Friedman SL.Hepatic fibrogenesis［J］.Semin Liver Dis，2007，27(4):413-426.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)［S］.北京:化学工业出版社，2000:110.

［3］聂莉，程德云，朱刚艳.龙血竭对肺纤维化大鼠肺组织转化生长因子β1mRNA及Ⅰ型胶原蛋白表达的影响［J］.河北中医，2010，32(7):1071-1072.

［4］彭伟，范红，宋正己.龙血素B对实验性肝纤维化的干预作用及机制［J］.中华消化杂志，2010，30(2):129-130.

［5］刘晓强，周海中，吴靖珍.肝病患者血清 HA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN测定的临床意义［J］.实用临床医药杂志，2009，13(6):40-42.