miR-451在胃癌组织中的表达及临床意义

汪 伟，刘晓峰，李文波，孙自勤，刘长江，李 晓

(1辽宁医学院济南军区总医院研究生培养基地，济南250031;2济南军区总医院)

胃癌是危害人类健康最常见的恶性肿瘤之一，居全球恶性肿瘤发病及病死率的第二位。然而病因及发病机制的不明确成为胃癌早期诊断困难、预后不佳的主要原因。MicroRNA(miRNA)是一类长约20～25个核苷酸的非编码的单链RNA分子。它通过与靶mRNA完全或不完全的互补配对，促进目标mRNA降解或抑制蛋白翻译，在细胞增殖、分化、凋亡、基因调控、免疫应答及肿瘤的发生中扮演重要的角色［1］。目前，miRNAs与肿瘤之间的关系已经成为肿瘤研究领域最受关注的分子之一，但其与胃癌的关系尚不明确。本研究使用RT-PCR技术检测胃癌组织及胃癌旁组织中miR-451的相对表达量，并分析其与胃癌相关临床因素的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 标本均取自2010年11月～2011年6月济南军区总医院普通外科18例胃癌患者的新鲜手术标本及消化内科内镜下活检取样标本，其中胃癌、癌旁手术标本8份，内镜下活检取样标本10份。男11例、女7例，年龄45～78岁、平均64.2岁，淋巴结转移6例、无淋巴结转移12例，远处转移2例、无转移16例。患者术前未做化疗或放射等抗肿瘤治疗。肿瘤配对标本癌组织经HE染色证实均为腺癌，所取正常组织距癌缘＞5 cm，HE染色证实为非癌组织，均无肠上皮化生或上皮内瘤变。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR检测miR-451的表达 取50～100 mg组织液氮研磨至粉末状，采用invitrogen公司TRIzol试剂说明书方法提取总RNA，并检测 OD260值。A260/A280比值范围在1.8～2.1之间为高纯度RNA，并用3%琼脂糖凝胶电泳法检测RNA的完整性，提取的总RNA于－70℃保存。采用invitrogen公司 SuperScript.Ⅲ First-Strand Synthesis System试剂说明书方法合成cDNA第一链，反转录合成的 cDNA于 －20℃保存。采用美国ABI公司SybrGreen PCR Master Mix(2X)试剂，并按照说明书进行实时定量 PCR，以 U6为内参。使用 ABI Stepone plus型荧光定量PCR仪，先以95℃ 10 min热启动，然后按95℃ 15 s，60℃ 1 min共40个循环，最后通过熔解曲线分析扩增产物的特异性。miR-451的相对表达量用2－ΔΔCt方法来表示。

1.2.2 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件，计量资料以¯x±s表示，胃癌组织与胃癌旁组织之间的表达差异使用配对样本t检验，并用独立样本t检测法、单因素方差分析法检测胃癌中miR-451的相对表达量与胃癌临床因素之间的关系。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织和胃癌旁组织miR-451的相对表达量 分析miR-451的扩增曲线图及溶解曲线图可得到单一的PCR扩增产物。胃癌组织和胃癌旁组织miR-451 的相对表达量分别为0.344 ±0.266、0.506±0.307。其中上调6例，下调12例，下调比率为66.67%(12/18)。胃癌组织与癌旁组织之间miR-451 差异存在统计学意义(t= －2.534，P=0.021)。2.2 miR-451在癌组织中的相对表达与临床病理因素相关性 见表1。

3 讨论

miRNA起源于内源性表达转录本，是长约20～25 nt的双链RNA分子，其典型特征是具有发卡结构。它们通过依赖于miRNA和靶基因的互补性两种不同的机制反向调控靶基因的表达。mRNA转录本在miRNA关联的多蛋白RNA介导的沉默复合体(miRISC)中被核酸酶剪切，导致靶mRNA的降解。miRNAs通过不完全的碱基配对和mRNA的3'非翻译区，在一个类似于或者可能是等同于RNA干扰途径中使用的RISC复合物中，在转录后水平上抑制基因翻译［2］。它们虽不编码蛋白质，但是却参与了细胞增殖、分化、凋亡、基因调控、免疫应答、肿瘤的发生、发展及预后等过程并扮演了重要的角色［1］。近年来随着miRNAs研究的深入，miRNA在肿瘤中充当着促癌基因和抑癌基因的双重角色。若miRNA在肿瘤中表达水平向上调节，则为促癌基因;若为向下调节则为抑癌基因。目前，围绕胃癌的miRNAs研究已经展开，研究较多的包括miR-21［3］、miR-27a［4］、miR-146a［5］等。众多的研究者通过使用基因芯片、RT-PCR、原位杂交等技术探讨了这些miRNAs在胃癌组织中的表达状况、作用机制及作用靶点，为揭示miRNA与肿瘤之间的关系提供了理论和方法学基础。

表1 胃癌组织中miR-451的表达与胃癌各因素之间的关系(¯x ± s)

近年国内外研究显示，miR-451与血细胞分化［6］、血液系统疾病［7］、心血管疾病［8］及肿瘤的发生等过程都有着密切联系。Hui等［9］发现miR-451在头颈鳞状细胞癌复发者中高表达;Gal等［10］研究提示，其在角质母细胞瘤干细胞(CD133+)中高表达;而 Kovalchuk 等［11，12］分别发现了 miR-451 参与调控多药耐药基因1在乳腺癌、卵巢癌中的表达。但miR-451与消化系统疾病的关系研究极少。Ban-dres等［13］通过RT-PCR技术探讨了石蜡包埋肿瘤组织中miR-451的表达情况，结果提示miR-451在胃癌组织和大肠癌组织中的表达均明显下调，并且其表达情况与细胞增殖、疾病预后及放化疗敏感性均有密切关系。国内学者吴春蓉等［14］通过RT-PCR及Western blotting技术验证了大肠癌细胞株中miR-451及巨噬细胞游走抑制因子(MIF)的表达情况。

目前，国内外文献中鲜有miR-451与胃癌的相关报道，并且未见在胃癌新鲜组织标本中的实验。PCR不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法，也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具。RT-PCR技术是一种具有革命性意义的定量PCR技术，将之用于新鲜胃癌组织中miR-451的研究，比用于石蜡包埋组织和细胞株具有更高的敏感性和特异性。本研究通过RT-PCR技术对新鲜胃癌组织与癌旁组织中miR-451进行表达量验证，结果证实了miR-451在胃癌组织与癌旁组织中存在统计学差异。miR-451在胃癌组织中明显低表达，提示其可能负向调控了肿瘤的发生。通过与临床相关因素关系的分析，也证实miR-451与胃癌的分化程度相关。

Bandres等［13］在体外实验中提出miR-451通过抑制致癌基因MIF调节细胞的增殖。MIF可能是miR-451的作用靶点之一。MIF可刺激肿瘤细胞的增殖、分化、浸润、转移以及抑制肿瘤细胞凋亡，因此在肿瘤的发生和进展过程中均起着十分重要的作用。关于MIF促进恶性肿瘤细胞浸润和转移的作用已屡有报道［15］，本试验结果显示，miR-451的低表达与肿瘤的浸润程度、转移作用无明显相关性，或许与样本例数较少有关。今后我们将扩大样本的例数来验证miR-451的作用靶点，并分析其与临床因素的相关性，以进一步确定miR-451在胃癌发生发展中的作用，为胃癌的预防和治疗提供一条新的思路。

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