己酮可可碱对人食管癌细胞EC9706的5-Fu化疗增敏作用

宋慧琴，李道明

(1河南大学第一附属医院，河南开封475000;2郑州大学第一附属医院)

己酮可可碱(PTX)为磷酸二酯酶抑制剂，能增加细胞内cAMP，并有改善血流动力学、免疫抑制和抗纤维化的作用。其可以抑制IκBα的磷酸化及降解，抑制NF-κB的活性。PTX在肿瘤治疗中的作用已引起人们的广泛关注，如PTX可去除化疗药物引起的细胞周期阻滞，增强顺铂、苯丙氨酸氮芥和柔红霉素等化疗药物的细胞毒性，激活凋亡信号途径，导致肿瘤细胞死亡［1］。5-氟尿嘧啶(5-Fu)作为胸苷酸合成酶抑制剂，是被广泛应用的化疗药物，当5-Fu进入体内，即转变为5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸，抑制脱氧胸苷酸合成酶，影响DNA合成［2］。2007年6月～2008年6月，本研究探讨了5-Fu和PTX联合5-Fu对EC9706细胞的抑制作用，为寻找治疗食管癌的新方法提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人食管癌细胞株EC9706由中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室惠赠。PTX由河南康诺医药公司惠赠，5-Fu购自上海旭东海普药业公司，四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 分组 对照组，不加药物，作为各处理组各剂量水平的共同对照;PTX处理组，设置0.01 mg/mL、0.10 mg/mL、0.50 mg/mL、1.00 mg/mL 4 个剂量水平;5-Fu处理组，设置25μg/mL、50μg/mL 2个剂量水平;PTX联合5-Fu处理组，设置8个剂量水平。见表1。

表1 PTX联合5-Fu用药浓度分组

1.2.2 MTT方法检测细胞生长情况 将1×105/mL EC9706细胞悬液接种于96孔培养板中，200 μL/孔，置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中。培养24 h后按分组加药，每组设6个复孔，继续培养12、24、48、72 h，每孔加入 20 μL/孔 MTT(5 mg/mL)继续培养4 h，吸去每孔液体，加入 DMSO 150μL/孔，振荡溶解15 min，以空白对照调零，用自动酶标仪在490 nm波长处测出各实验组的OD值。求平均值，计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率=(对照组OD值－实验组OD值)/对照组OD值×100%。

1.2.3 统计学方法 采用 SPSS10.0统计软件，结果以¯x±s表示。将所有数据进行正态性和方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，进一步两两比较采用 LSD-t检验。P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 5-Fu、PTX联合5-Fu作用后细胞形态学观察结果 倒置显微镜下观察，对照组的细胞均呈上皮性贴壁生长，细胞轮廓清楚，细胞间结构紧密，生长旺盛，随时间延长，细胞层次增多。与对照组相比，5-Fu处理组细胞24 h出现部分细胞皱缩，漂浮，胞质浑浊，并随时间延长和药物浓度增高，数量减少，出现细胞碎片。见图1～4。与对照组相比，PTX联合5-Fu处理组细胞12 h即出现部分细胞皱缩，漂浮，胞质浑浊，并随时间延长和药物浓度增高，细胞数量更少，出现大量漂浮细胞和细胞碎片。见图5～8。

图1 ～4 25μg/mL 5-Fu组细胞12～72 h生长情况(400×)

图5 ～8 0.5 mg/mL PTX联合5-Fu组细胞12～72 h生长情况 (400×)

2.2 5-Fu、PTX联合5-Fu对EC9706细胞的增殖抑制结果 见表2、3。

3 讨论

表2 不同时间25μg/mL 5-Fu、PTX联合5-Fu对EC9706细胞的增殖抑制作用(¯x±s)

表3 不同时间50μg/mL 5-Fu、PTX联合5-Fu对EC9706细胞的增殖抑制作用(¯x±s)

食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其中河南省尤为高发。在我国食管癌病死率居恶性肿瘤的第四位［3］，严重威胁着人们的健康和生命。5-Fu是食管癌的常规化疗药物，然而，食管癌对化疗药物的敏感性较低。化疗耐药是化疗药物疗效偏低的主要原因，是当今肿瘤治疗的一大难题，也是综合治疗失败的一个重要原因。

PTX作为一种非选择性磷酸二酯酶抑制剂，可抑制IκBα的磷酸化及其降解，从而抑制内毒素诱导的 NF-κB 的活性［4］。Futakuchi等［5］研究发现，PTX可明显抑制荷瘤小鼠肝细胞癌的NF-κB的活性，减少肺转移几率。近年研究表明，NF-κB的转录活性被大多数前凋亡信号包括TNF-α、抗肿瘤药物、电离辐射所激活，从而诱导凋亡抑制基因表达，对抗化疗药物引起的细胞凋亡，这是诱导肿瘤化疗耐药性的主要机制。抑制NF-κB转录活性能促进肿瘤细胞发生凋亡［6］，提高肿瘤细胞对化疗、放疗的敏感性。

有研究发现，PTX可以增强(E)-(2’)-脱氧—氟亚甲基胞苷对结肠癌和宫颈癌的细胞毒性和对放射的增敏作用［7，8］，然而，关于 PTX 增加化疗药敏感性的机制目前还不是很清楚，有学者认为PTX可以去除化疗药物引起的S期阻滞，使细胞携带未修复的DNA损伤进入下一周期，激活凋亡信号途径，导致肿瘤细胞死亡［7］。Eley等［9］发现，PTX 增强 p53突变或缺失肿瘤细胞对放疗的敏感性。Honess等［10］发现，PTX可增加肿瘤的血液灌注，提高肿瘤细胞的供氧、从而增强了细胞的化疗敏感性。而PTX对体外培养肿瘤细胞的作用国内外尚未见报道。

本研究中细胞形态学观察结果显示，5-Fu、PTX联合5-Fu作用于EC9706细胞12～72 h，在同一时间段，随着5-Fu和PTX药物浓度的增加，对EC9706细胞的抑制作用也增强，而PTX联合5-Fu组与单用5-Fu组相比，对EC9706细胞的抑制作用出现得早，强度大。说明PTX可以增加5-Fu对EC9706细胞的抑制作用。MTT结果显示，5-Fu、PTX联合5-Fu作用于 EC9706 12～72 h，在同一时间段，随着PTX药物浓度的增加，5-Fu对EC9706细胞的抑制作用也增强，联合组Ⅲ、Ⅳ(PTX 0.5 mg/mL、1.0 mg/mL与5-Fu 25μg/mL联合组)与50μg/mL 5-Fu组EC9706细胞抑制率相近。PTX尤其是在中高浓度对25μg/mL 5-Fu的化疗增敏作用明显，而PTX对50μg/mL 5-Fu增敏作用较差。说明PTX可以增加EC9706细胞对5-Fu的敏感性，减少5-Fu的剂量。

目前，PTX已经广泛应用于慢性周围血管和静脉循环障碍引起的疾病，安全性能好。本研究结果提示，PTX可以使5-Fu对EC9706细胞的抑制作用提前出现，并使EC9706细胞对5-Fu更具有敏感性，从而可以减少5-Fu的剂量。如果将PTX应用于食管癌的化疗可能具有非常实际的意义。

［1］Binder AB，Serafin AM，Bohm LJ.Abrogation of G(2)/M-phase block enhances the cytotoxicity of daunorubicin，melphalan and cisplatin in TP53 mutant human tumor cells［J］.Radiat Res，2000，154(6):640-649.

［2］ Lenz HJ.Pharmacogenomics and colorectal cancer［J］.Ann Oncol，2004，15(Suppl 4):173-177.

［3］李连弟，鲁凤珠.全国恶性肿瘤死亡抽样调查报告［J］.中国肿瘤，1996，5(1):3-7.

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［5］Futakuchi M，Ogawa K，Tamano S，et al.Suppression of metastasis by nuclear factor kappaB inhibitors in an in vivo lung metastasis model of chemically induced hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Sci，2004，95(1):18-24.

［6］Russo SM，Tepper JE，Baldwin ASJr，et al.Enhancement of radiosensitivity by proteasome inhibition:implications for a role of NF-kappaB［J］.Int JRadiat Oncol Biol Phys，2001，50(1):183-193.

［7］李晔雄，Phlippe A.己酮可可碱增强(E)-(2’)-脱氧-氟亚甲基胞苷(FMdC)的细胞毒性和对宫颈癌细胞的放射增敏作用［J］.癌症，2001，20(7):718-722.

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［9］Eley KW，Benedict SH，Chung TD，et al.The effects of pentoxifylline on the survivial of human glioma cells with continuous and intermittent stereotactic radiosurgery irradiation［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2002，54(2):542-550.

［10］Honess DJ，Andrews MS，Ward R，et al.Pentoxifylline increase RIF-1 tumor PO2in a manner compatible with its ability to increase relative tumor perfusion［J］.Acta Oncol，1995，34(3):385-389.