磷酸肌酸后适应联合缺血后适应减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤

张会珍，邢艳秋，章 萌，肖 冬，寇学俊，王 慧

(1山东省医学科学院基础医学研究所，济南250062;2济南医院;3山东大学齐鲁医院)

急性心肌梗死是常见的心血管疾病，早期溶栓和介入治疗虽然开通了罪犯血管，一定程度上挽救了濒死心肌，降低了发病率和病死率［1］，但再灌注的同时，随着血运的恢复，某些受损的心肌细胞功能及结构破坏反而加重，临床上出现心律失常、心梗面积扩大等并发症。缺血后适应作为一种新的治疗策略，能够有效减轻心肌再灌注损伤。2010年12月～2011年12月，本研究在缺血后适应的基础上加用外源性磷酸肌酸，观察其对进一步减轻缺血再灌注损伤的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级健康雄性Wistar大鼠40只，体质量260～290 g，购自山东大学实验动物中心。小动物呼吸机、离心机、心电图机、酶标仪、恒温恒湿箱等由山东大学教育部、卫生部心血管重构与功能研究重点实验室提供。伊文思蓝购于美国Sigma公司，氯化三苯基四氮唑(TTC)购于美国Amresco公司。肌酸激酶(CK)试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、髓过氧化物酶(MPO)试剂盒均购于南京建成生物工程有限公司。NF-κB酶联免疫吸附测定试剂盒购于上海蓝基生物有限公司。磷酸肌酸购于意大利阿尔法韦士曼制药公司。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备及分组 大鼠采用30 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，气管切开，连接小动物呼吸机进行机械通气，分离肌层，沿胸骨左缘切开第3、4肋间，剪开心包，暴露心脏、左心耳及肺动脉圆锥，在左心耳下方2 mm、肺动脉圆锥左缘之间穿线进针，以冠状静脉为标志穿入7-0丝线用于结扎左冠状动脉前降支(LAD)，同时将一内径1.5 mm的乳胶管置于结扎线和LAD之间，拉紧结扎线使乳胶管压迫LAD，造成急性心肌缺血。缺血30 min后，拔出乳胶管，冠状动脉再通，形成再灌注。实验中以左室前壁出现紫绀及心电图Ⅱ导联ST段抬高为心肌缺血成功。冠状动脉阻塞前经尾静脉注射肝素钠300 U/kg抗凝。按抽签法将大鼠随机分为假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、缺血后适应组(IPost组)、磷酸肌酸后适应+缺血后适应组(Pcr+IPost组)各10只，均予心肌缺血30 min，再灌注120 min处理。Sham组冠状动脉只穿线不结扎;I/R组缺血30 min后直接再灌注;IPost组再灌注前给予3次再灌注10 s/缺血10 s处理;Pcr+IPost组再灌注前5 min经股静脉缓慢注射磷酸肌酸200 mg/kg，再灌注前同时予3次再灌注10 s/缺血10 s处理。Sham组、I/R组、IPost组分别给予等量生理盐水。

1.2.2 检测方法 于再灌注2 h末抽取股静脉血2 mL，3 000 r/min离心15 min，取上清于-80℃保存待测。①血清CK、LDH、MPO活性测定:采用比色法测定CK、LDH、MPO的酶活力，按试剂盒说明书操作。②血清NF-κB检测:采用酶联免疫吸附法检测，根据标准品制备蛋白曲线，检测样品的OD值，根据标准蛋白曲线测定样品的蛋白浓度，具体操作参照试剂盒说明书。③心肌梗死面积的测定:实验结束后，原位结扎冠状动脉，经颈静脉注入1%的伊文思蓝2～3 mL，待巩膜、皮肤蓝染后已将非缺血心肌染成蓝色，从而显示出缺血危险区心肌。10%氯化钾处死动物，立即摘取心脏，生理盐水冲掉残余的染料后，去除大血管、心房及右心室，-20℃冷冻10 min，沿左心室长轴横切为4～5片1～2 mm厚的心肌片，置1%TTC中，37℃孵育20 min，此时坏死区呈灰白色，非坏死心肌呈砖红色，非缺血心肌呈蓝紫色。最后将切片置于10%甲醛中固定15 min。将分离好的心肌组织分别称质量，心肌缺血危险区面积以缺血区心肌质量/左室质量来表示，心肌梗死面积以坏死区心肌质量/缺血区心肌质量来表示。

1.2.3 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件进行数据分析;计量资料以¯x±s表示，多组均数及组间两两比较分别采用单因素方差分析和最小显著差异法(LSD法);两指标间相关性分析采用Spearman相关分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清CK、LDH活性比较 见表1。

表1 各组血清CK、LDH活性比较(U/L，¯x±s)

2.2 各组血清MPO、NF-κB比较 见表2。

表2 各组血清 MPO、NF-κB 比较(¯x±s)

2.3 各组体质量、左室质量、心肌缺血及梗死面积比较 见表3。

表3 各组体质量、左室质量、心肌缺血及梗死面积比较(¯x ±s)

2.4 相关性分析 Sperman相关分析结果显示，NF-κB 与 MPO 呈正相关(P ＜0.05)。

3 讨论

缺血后适应是指在较长心肌缺血后再灌注开始之前，立即给予3个周期的短暂停灌、复灌处理，即30 s再灌注、30 s再阻断，反复3次，具有缩小心肌梗死面积、保护冠状动脉内皮功能及减轻缺血心肌炎症反应等作用，与缺血预适应有相似的心脏保护作用，并将这种现象称为“缺血后适应”［2］。大量动物实验证实，缺血后适应能够降低心肌梗死面积、改善左室功能，同时具有保护内皮以及抗心肌细胞凋亡的作用。本研究采用3个周期的10 s缺血、10 s再灌注，结果也显示缺血后适应可以明显减少心肌酶释放，降低心肌梗死面积，起到很好的心脏保护作用。近年来，缺血后适应逐渐被临床应用。Zhao等［3，4］研究显示，应用缺血后适应可以减少心肌酶的释放、改善左室功能。磷酸肌酸是一个非常重要的能量底物，分子结构特征中具有P-N型高能磷酸键，其分子两端均为负电荷基团，能直接给细胞供应能量，具有3倍二磷酸果糖和1.5倍三磷酸腺苷(ATP)的能量水平，而且对细胞膜磷脂有很好的稳定作用;同时磷酸肌酸在能量代谢中起到储存和转运ATP的双重功能，而ATP是细胞代谢过程中最主要的能量源，故组织缺血时磷酸肌酸可能成为一种最主要最直接的供能物质。目前，临床上对磷酸肌酸的应用主要是慢性充血性心力衰竭、多种心脏外科手术的心脏停搏液中，在心肌急性缺血患者中也逐渐开始应用。国内彭志坚等［5］对经PCI的患者应用磷酸肌酸，结果显示患者CK-MB峰值降低，ST段抬高总和回落百分比高于对照组;Prabhakar等［6］建立非体外循环的冠状动脉旁路移植术小鼠动物模型，在外科手术前经100 mg/kg磷酸肌酸预处理，结果显示磷酸肌酸给药组不仅提高了正常心肌组织内磷酸肌酸/ATP的水平，也提高了缺血心肌内的水平，减轻了代谢应激带来的不良反应。以上研究均是在再灌注的基础上应用磷酸肌酸，本研究首次采用磷酸肌酸后适应联合缺血后适应的动物模型，发现两者联用可进一步降低大鼠血清CK、LDH活性，减少心肌梗死面积，使其保护心脏作用明显提高。

目前，关于磷酸肌酸对抗心肌缺血的机制仍不十分清楚。Yang等［7］研究显示，在磷酸肌酸缺乏的情况下，肌浆网内钙离子比较低，会发生自发性钙离子释放，造成钙超负荷，对心肌细胞产生损伤，间接提示磷酸肌酸可能有减轻钙超载的作用。研究证明，缺血再灌注损伤的主要机制除大量氧自由基的产生、钙离子超负荷外，中性粒细胞的活化以及多种炎症介质及信号转导分子也发挥了重要作用。MPO是中性粒细胞嗜天青颗粒中含量较高的酶，其活性高低可反映中性粒细胞的浸润程度。NF-κB是一个关键的可诱导的转录因子，能调节与重要生物过程有关的许多基因的表达，包括炎症应激反应和细胞生存。正常情况下，NF-κB通过与NF-κB抑制剂和锚定蛋白重复结构域结合，以非活化的形式存在于细胞质中;它能通过白介素-1、肿瘤坏死因子α、氧化应激等的激活，并向细胞核移位，从而激活目的基因转录，NF-κB活化的最终结果是促进炎症基因的活化，而这些炎症因子的升高又可以进一步促进NF-κB的活化，起到信号级联放大作用，进而造成心肌的炎症反应、细胞凋亡和坏死［9］。本研究显示，缺血再灌注时血清MPO活性增加、NF-κB活化明显上调，应用缺血后适应后，血清MPO与再灌注组比较明显下降，NF-κB活化明显降低，在缺血后适应的基础上应用外源性磷酸肌酸，血清MPO进一步降低，NF-κB活化也进一步降低。提示磷酸肌酸有降低血清 MPO活性和抑制 NF-κB活化的作用。Spearman相关分析显示，NF-κB与MPO呈显著正相关，MPO随着NF-κB的降低而明显降低。因MPO是反映炎性浸润的指标，而NF-κB是导致炎性因子释放增加的始动因子，由此推测，磷酸肌酸联合缺血后适应减轻大鼠缺血再灌注损伤的机制可能是通过抑制NF-κB活化途径来抑制中性粒细胞聚集，从而抑制炎症反应，保护心肌组织。

综上所述，缺血后适应可以减轻缺血再灌注损伤，联合磷酸肌酸后适应后，缺血再灌注损伤进一步减低，其机制可能与抑制NF-κB活化途径介导的炎症反应有关，两者联合起到了更好的保护作用。

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［4］Lønborg J，Kelbaek H，Vejlstrup N，et al.Cardioprotective effects of ischemic postconditioning in patients treated with primary percutaneous coronary intervention，evaluated by magnetic resonance［J］.Circ Cardiovasc Interv，2010，3(1):34-41.

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［6］Prabhakar G，Vona-Davis L，Murray D，et al.Phosphocreatine restores high-energy phosphates in ischemic myocardium:implication for off-pump cardiac revascularization［J］.J Am Coll Surg，2003，197(5):786-791.

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