姜黄素对溃疡性结肠炎大鼠的抗炎作用及其对肠黏膜IL-23的影响

廖 辉，曾昭静，吕小平，詹灵凌，陈 兰

(1广西医科大学第一附属医院西院，广西南宁530021;2广西医科大学第一附属医院临床医学实验部)

炎症性肠病(IBD)是一组慢性非特异性肠道炎症性疾病，主要表现为长期反复发作的腹痛、腹泻、黏液脓血便，具有慢性和消耗性的特征，包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。该病在欧美国家发病率比较高，近年我国的发病率及患病率也在上升。至今IBD的病因和发病机制尚未完全明确，目前公认，免疫调节异常在IBD发生发展中起重要作用。已有研究表明，IL-23/IL-17轴在IBD的发病机制中可能处于关键地位［1，2］，并有望成为 IBD 新的治疗靶标。现阶段，IBD的治疗手段非常有限，药物治疗主要以5-氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂和生物制剂为主，但都存在不同的局限性和毒副作用。姜黄素是从姜科植物中提取的一种相对分子质量小的多酚类物质，具有一定的免疫调节、炎症抑制功能。2010年6月～2011年5月，本研究应用姜黄素干预实验性大鼠结肠炎模型，探讨其对IL-23表达的影响及对实验性大鼠结肠炎的治疗作用，进一步研究IBD的病因和发病机制。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物:健康成年雄性SD大鼠80只，体质量180～220 g，购自广西医科大学实验动物中心。主要试剂:姜黄素购自BBI公司、三硝基苯磺酸(TNBS)购自sigma公司、柳氮磺吡啶(SASP)购自上海三维药业有限公司、抗体购自santa cruz公司，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组及模型建立 将80只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、姜黄素组、SASP组，每组均为20只。模型组、姜黄素组、SASP组大鼠分别以100 mg/kg TNBS乙醇溶液灌肠制备大鼠结肠炎模型，TNBS模型参照Morris等方法制作:大鼠禁食24 h，水合氯醛麻醉后由肛门插入硅胶管至肠道内约8 cm，一次性结肠灌注100 mg/kg TNBS(溶于50%乙醇溶液，总体积为1 mL)，提起尾部倒立3 min后，放回笼内常规饲养。正常对照组予相同剂量的0.9%氯化钠溶液灌肠;正常对照组、模型组每日予相同剂量的0.9%氯化钠溶液灌胃;姜黄素组自造模第2天起每日予100 mg/kg姜黄素溶液灌胃;SASP组大鼠也于造模第2天每日予100 mg/kg的SASP溶液灌胃。造模第8天处死大鼠，采集大鼠结肠标本备检。

1.2.2 症状、体征观察及评分 造模后观察各组大鼠体质量变化、大便性状、便血情况，参照Okayasu等［3］的经典评分系统方法，每日将体质量下降、大便性状和隐血或便血情况的评分相加，作为疾病活动指数(DAI)(DAI=体质量减轻率分数+大便性状分数+隐血程度分数/3)。

1.2.3 标本采集及结肠黏膜组织学损伤评分 光镜观察结肠黏膜组织病理学变化，并进行炎症损伤评分:造模第8天处死大鼠，距肛门2、6、10 cm处取3段长约1 cm的大鼠结肠组织，制备石蜡切片，行苏木精—伊红(HE)染色，以盲法观察，在光学显微镜下观察肠黏膜损伤情况，参照 Butzner等［4，5］CMDI、Dieleman评分标准进行评分。

1.2.4 肠黏膜组织IL-23 mRNA水平的测定 采用RT-PCR法。按Trizol法提取各组大鼠结肠组织总RNA，使用分光光度计检测总RNA的浓度之后，进行逆转录反应合成cDNA，并取逆转录产物cDNA用于PCR扩增，取PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统成像，目标mRNA的表达量使用内参照β-actin进行校正。紫外灯下以凝胶图像扫描仪测A值，用GAPDH校正半定量，计算目的基因相对表达水平。RT-PCR引物序列:IL-23 p19:上游引物:5'-CTGACAGACTCTGCTTCCTCGCTAC-3';下游引物:5'-CGAACAGCCCGAGATAGGACAAG-3'(355 bp);β-actin:上游引物:5'-CCCATACCCAC CATCACACC-3';下游引物:5'-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'(207 bp)。RT-PCR反应条件:PCR Mix 12.5 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 模版1.5 μL，加DEPC-treated water至25μl。反应条件为:95℃，5 min;94 ℃，30 s;55 ℃，30 s;72 ℃，45 s，共 35个循环;最后72℃，7 min。

1.2.5 肠黏膜组织IL-23蛋白表达水平的测定

采用Western blot提取各组大鼠肠黏膜组织中的总蛋白，使用BCA蛋白定量试剂盒在570 nm波长处测定总蛋白浓度。蛋白经过10%SDS-PAGE电泳后，将凝胶中蛋白电转移至硝酸纤维素膜上，以5%脱脂奶粉TBS液封闭后，加入一抗摇床孵育过夜，洗涤后加入二抗，室温孵育80 min后，ECL底物化学发光显色后曝光显影。目标条带使用图像分析软件进行分析，目标蛋白表达量使用β-actin进行校正。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验;计量资料以¯x±s表示，多组间比较采用完全随机设计方差分析，组间两两比较采用最小显著差法(LSD)检验;两变量间相关关系的分析采用直线相关分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况、结肠组织大体形态及组织学评分 见表1、图1。

2.2 各组结肠组织IL-23的表达 见表2、图2、图3。

表1 各组DAI及肠黏膜组织损伤评分(分，¯x±s)

图1 结肠组织镜下观察(HE×200)

表2 各组大鼠结肠组织IL-23 mRNA和蛋白的表达(¯x±s)

图2 各组结肠组织IL-23 mRNA表达

图3 各组结肠组织IL-23蛋白表达

3 讨论

IBD是一组病因未明的非特异慢性肠道炎症性疾病，现已成为消化系统常见病及慢性腹泻的主要病因。其发病机制尚不完全明确，有研究显示，肠壁黏膜免疫调节异常、持续肠道感染、肠壁黏膜屏障缺损、遗传和环境等因素共同参与该疾病的发生发展［6，7］，其中先天性免疫和适应性免疫调节异常在IBD的发生、发展过程中发挥着重要作用［8］。

IL-23是IL-12分子家族中的促炎性细胞因子，主要是由激活的单核—巨噬细胞和树突状细胞分泌，由IL-12p40和IL-23p19亚单位组成。IL-23具有十分复杂的生物学功能，参与机体控制感染和自身免疫性疾病发生［9～11］。其主要介导 Th17细胞群的扩增并维持其存活，Th17细胞主要介导机体的炎性反应(防御胞外病原菌的感染)、自身免疫反应、IBD、肿瘤和移植排斥等的发生和发展，具有高致病性［10］。研究表明，IL-23在某些自身免疫性疾病中的表达增高，如实验性过敏性脑脊髓炎、胶原诱导性关节炎及人类银屑病等［12］。近年国外研究证实，IL-23 在 IBD 的发生中起重要作用［10，13］，其可通过诱导并驱动Th17细胞产生IL-17、IL-6和TNF-α等，引起炎症细胞因子级联反应，形成结肠炎症。刘占举等［14］发现 IL-23在 IBD中表达增高，并能诱导IBD患者淋巴细胞效应应答，促使肠黏膜炎性反应，尤其是CD患者肠黏膜炎性肉芽肿形成，导致黏膜组织损伤、肠壁黏膜增厚。

已有研究表明，IL-23/IL-17轴在IBD的发病机制中可能处于关键地位［1，2］。另有动物实验表明，敲除IL-23和IL-12共有的p40基因或用单克隆抗体中和治疗处理后TNBS未能诱发出小鼠结肠炎［2］。Kullberg 等［15］在小鼠结肠炎模型中，通过将幼稚的T淋巴细胞转移至免疫缺陷型、RAG基因敲除小鼠中，引起宿主肠道感染，发现结肠炎在p19和p40缺陷型小鼠中可被抑制，而在IL-12特异性亚基p35缺陷型小鼠中不能被抑制，结肠炎的抑制程度与炎性因子TNF、IL-6、IFN-γ的减少有相关性。可见，IL-23通过激活潜在的 T细胞介导的免疫反应在肠道感染的发生、发展中起重要作用。有关人体IBD的研究发现，IL-23p19 mRNA在 CD患者的转录水平明显升高，在UC患者轻度升高，在特异性肠炎和正常人中没有升高［16］。Fuss等［17］也发现 CD患者中IL-23水平升高，并且用 IL-12p40 mAb治疗后IL-23的水平下降。以上结果均提示IL-23在IBD的发病机制中可能起关键作用。

本实验采用Western blot法检测大鼠结肠组织的IL-23p19蛋白水平，RT-PCR法测大鼠结肠组织IL-23 mRNA的表达，发现模型组大鼠的IL-23 mRNA和蛋白表达水平与正常对照组相比均显著升高，且与疾病活动指数呈正相关，与Yen等［18］研究结果一致，提示IL-23在大鼠结肠炎的发生中发挥着重要作用，并与疾病严重程度相关。

国内外多项研究表明，姜黄素可调控IBD大鼠模型中的炎症因子表达，简燕婷等［19］用姜黄素干预IBD大鼠模型发现能使肠黏膜细胞致炎因子IL-1β mRNA的表达受抑制，而抗炎因子IL-10 mRNA的表达增强;夏剑等［20］报道实验性结肠炎中，姜黄素通过抑制NF-κB、TNF-α表达而达到抗炎效果;张明等［21］研究发现姜黄素抗炎作用与抑制IL-12调节Thl/Th2细胞因子平衡有关。

本研究发现，模型组大鼠精神差、毛色粗糙、排血便或无排便，体质量明显下降，至造模结束仍低于造模前水平，炎性指标IL-23 mRNA及蛋白表达显著增高;姜黄素组大鼠经姜黄素治疗后上述改变均得到明显改善，体质量逐渐恢复或超越造模前水平，大鼠的DAI、大体形态和组织学损伤情况均明显降低，IL-23 mRNA及蛋白表达下降。说明姜黄素能够降低IL-23的蛋白及mRNA表达水平，对实验性大鼠结肠炎有明显的抑制作用，其是治疗IBD大鼠模型的有效药物。

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