吉非替尼在H3255突变细胞株凋亡中的作用及对BIM表达的影响

庞龙滨，贺韦东，邢春燕，张 萍，陈 敏

(1济南市中心医院，济南250014;2山东省血液中心)

促凋亡蛋白(BIM)是Bcl-2家族中仅含一个BH3结构域的蛋白，具有促凋亡活性，广泛分布于机体各种组织，对防御自身免疫、维持造血细胞稳态有重要意义，并有肿瘤抑制因子活性［1～3］。2011年6～10月，我们观察了吉非替尼干预及BIM重组腺病毒转染对表皮生长因子受体(EGFR)基因突变H3255肺腺癌细胞株(以下简称H3255)凋亡及BIM表达的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 H3255(北京协和细胞资源中心)。RPMI1640、FBS(Gibco公司)。SDS-PAGE凝胶配置试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、Annexin PI单染凋亡检测试剂盒(江苏碧云天公司)。一抗BIM抗体(H-191，兔抗人，Santa Cruz公司)，抗 Actin抗体(TA-09，鼠抗人，北京中杉金桥公司)。二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)和辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)(北京中杉金桥公司)。DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(中杉金桥公司)，BIM重组腺病毒(吉凯公司)，吉非替尼［英国阿斯利康公司，将吉非替尼250 mg溶于二甲基亚砜(DMSO)中配成工作浓度0.01 mmol/L，分装于EP管，－80℃保存］。

1.2 细胞培养及干预 将H3255置于含10%FBS的RPMI1640培养液的25 cm2培养瓶中，于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。待细胞融合达80%以上时行0.25%胰蛋白酶消化传代。取对数生长期细胞，将其随机分为5组，吉非替尼组将H3255按1×106/L浓度接种于24孔板培养过夜，然后加入1μmol/L吉非替尼培养48 h;DMSO对照组仅加入0.1%DMSO培养48 h;转染组以BIM重组腺病毒转染，阴性对照组以不带BIM的空载体转染，空白对照组不转染，将相应的腺病毒量分别按200、200、0感染复数(MOI)加入到接种好的细胞中混匀，置于37℃、5%CO2培养箱中培养4～6 h后更换含10%FBS的RPMI1640培养液继续培养48 h。

1.3 观察项目

1.3.1 细胞凋亡率 采用Annexin PI单染法。将上述各组贴壁细胞用酶消化后制成单细胞悬液，用PBS洗涤1次，低速离心弃上清，加入预冷的无水乙醇，终浓度为70%，4℃避光过夜。离心去固定液，PBS洗涤1次，低速离心弃上清，每孔加1 mL的PI染液，4℃避光30 min后上流式细胞仪检测细胞凋亡率。每组实验重复3次。

1.3.2 BIM蛋白表达 采用Western blot法。将上述各组贴壁细胞用预冷 PBS洗1次，加1×(含SDS)Loading buffer裂解细胞，用软刮子将细胞刮下来，并转移至EP管，保持在冰上剪切DNA 10～15 s，降低样本黏滞度。95～100℃加热10 min，冰上冷却，4℃离心11 000 g×4 min吸取上清至EP管中(此为细胞总蛋白)，－80℃保存。样品上样量均20μL，于SDS-PAGE凝胶4℃ 90 V电压电泳2～2.5 h，于4℃稳流50 mA转膜12～14 h后，用5%W/V脱脂牛奶封闭1 h，TBST洗3次。将目的蛋白和内参的膜剪开，分别加兔抗人BIM抗体(1∶500)和鼠抗人Actin抗体(1∶1 000)4℃孵育过夜，TBST洗3次。分别加辣根过氧化物酶标记的相应的二抗(1∶1 000)室温孵育2 h，TBST洗3次。用DAB辣根过氧化物酶显色方法显色，扫描图像保存。

1.4 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件，计量数据以¯x±s表示，采用单因素方差分析及t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞凋亡率 吉非替尼组、DMSO对照组、转染组、阴性对照组、空白对照组细胞凋亡率分别为(58.04 ± 3.15)%、(12.30 ± 2.96)%、(51.43 ±12.73)%、(12.73 ±2.40)%、(8.77 ± 1.52)%，吉非替尼组与DMSO对照组比较及转染组与阴性对照组、空白对照组比较，P均＜0.01，而吉非替尼组与转染组比较差异无统计学意义。

2.2 BIM蛋白表达 与DMSO对照组比较，吉非替尼组BIM蛋白表达水平明显增高，见图1A。与阴性对照组、空白对照组比较，转染组BIM蛋白表达显著增高，见图1B。

图1 H3255细胞株BIM蛋白表达

3 讨论

近年来肺癌发病率逐年上升，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占80% ～85%［4］;靶向治疗是肺癌治疗的一种新方法，且近年来取得较大进展，可明显提高患者的5年生存率。吉非替尼为NSCLC靶向治疗的代表性药物，是信号传导通路酪氨酸激酶抑制剂。以腺病毒为载体的基因治疗亦为目前研究的热点。国内外多项研究表明BIM在肿瘤细胞凋亡中伴有重要角色，有望成为肿瘤靶向治疗的新靶点。BIM为促细胞凋亡蛋白多肽，是Bcl-2家族成员，仅具有一个BH3结构域，可通过拮抗抗凋亡因子的作用或直接与Bax等相互作用并共同转位到线粒体膜上引起细胞色素C释放而诱导凋亡。BIM(BIM-EL)在人类基因组中位于2q12-q13，含有6个外显子，第三个外显子被选择性剪切掉后其mRNA将被翻译成BIM 较短的两个存在形式 BIML和 BIMS［5］。Costa等［6］研究证实，对吉非替尼等靶向治疗药物有效的肺癌患者，其癌细胞内BIM表达数量显著增加，而BIM基因敲除后可使原来敏感的肿瘤细胞对靶向药物耐药，说明BIM在靶向治疗药物介导的肿瘤细胞凋亡过程中发挥重要作用。

有研究认为不同EGFR突变株对吉非替尼的敏感性不同，H3255存在第21外显子2 573氨基酸位的 T→G(L858R)［7］。Kobayashi等［8］研究发现吉非替尼诱导EGFR-L858R突变株凋亡的能力明显高于-L858R-T790M突变株。本研究首先采用吉非替尼作用于EGFR突变的H3255，发现吉非替尼能诱导H3255凋亡，且H3255表达BIM-EL亦明显增高。之后我们将重组腺病毒BIM转染至H3255肿瘤细胞中，发现与未转染的H3255相比，BIM蛋白表达增高，且细胞凋亡率相应增高。统计学分析发现，BIM重组腺病毒转染和吉非替尼药物干预的促凋亡率相近，因此我们认为通过此种分子生物学方法亦可直接促使H3255细胞内的BIM过表达并促进H3255细胞凋亡，且与吉非替尼药物干预的效果相同。

综上所述，吉非替尼与BIM重组腺病毒均可促使H3255细胞突变株(L858R)BIM呈高表达，并促进H3255细胞凋亡，且二者凋亡率相近，推测吉非替尼对存在EGFR突变的NSCLC细胞株的促凋亡作用机制可能与增强BIM表达有关。

［1］Strasser A，Puthalakath H，Bouillet P，et al.The role of Bim，aproapoptotic BH3-only member of the Bcl-2 family in cell-death control［J］.Ann NY Acad Sci，2000，917(1):541-558.

［2］Sunters A，Madureir PA，Pomeranz KM，et al.Paclitaxel-induced nuclear translocation of FOXO3a in breast cancer cells is mediated by c-Jun NH2-terminal kinase and Akt［J］.Cancer Res，2006，66(1):212-220.

［3］Desbien AL，Kappler JW，Marrack P.The Epstein-Barr virus Bcl-2 homolog，BHRF1，blocks apoptosis by binding to a limited amount of Bim［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(14):5663-5668.

［4］王聪慧，陆友金.非小细胞肺癌中TMSl基因甲基化检测［J］.安徽医科大学学报，2008，43(1):46-49.

［5］Bouillet P，Zhang LC，Huang DC，et al.Gene structure alternative splicing，and chromosomal localization of pro-apoptotic Bcl-2 relative Bim［J］.Mamm Genome，2001，12(2):163-168.

［6］Costa DB，Halmos B，Kumar A，et al.BIM mediates EGFR tyrosine kinase inhibitor-induced apoptosis in lung cancers with oncogenic EGFR mutations［J］.PLoSMed，2007，4(10):1669-1680.

［7］Gong Y，Somwar R，Politi K，et al.Induction of BIM is essential for apoptosis triggered by EGFR kinase inhibitors in mutant EGFR-dependent lung adenocarcinomas［J］.PLoS Med，2007，4(10):e294.

［8］Kobayashi S，Ji H，Yuza Y，et al.An alternative inhibitor overcomes resistance caused by a mutation of the epidermal growth factor receptor［J］.Cancer Res，2005，65(16):7096-7101.