siRNA干扰沉默EZH2基因对人肝癌HepG2细胞增殖的影响

庞玉艳，冯震博，李 佳，危丹明

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

EZH2(Enhancer of zeste homolog 2)是果蝇Zeste基因增强子的人类同源基因，为Polycomb group(PcG)基因家族的重要成员之一。PcG是进化过程中保守的染色质修饰基因，在胚胎发育、干细胞自我更新和肿瘤发生、发展中起重要作用［1］，EZH2为其核心成分，可促进细胞增殖，多项研究显示其过量表达与结直肠癌、乳腺癌、肝癌等多种肿瘤发生、发展和预后相关［2～4］。抑制沉默EZH2基因表达可能成为一种潜在的基因治疗新方法。2011年3～7月，我们以小分子RNA(siRNA)干扰技术通过Lipofectamine2000脂质体转染靶细胞，沉默靶基因EZH2，在细胞和蛋白水平上观察siRNA对EZH2基因表达的影响，旨在为肝癌的基因治疗提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌HepG2细胞株、流式细胞周期检测试剂盒、细胞培养基DMEM均购自KeyGEN，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料所，MTT试剂盒、细胞总蛋白抽提试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒(Bryotime)，Lipofectamine2000、TRizol试剂(Invitrogen)，ReverTra Ace-α First Strand cDNA Synthesis Kit及SyBR Green Real Time PCR Master MIX购自日本东洋纺(TOYOBO)生物科技(上海)有限公司。兔抗人β-actin多克隆抗体、兔抗人EZH2多克隆抗体(Epitomics公司)，EZH2 siRNA、Negative control FAM(N.C-FAM)均由上海吉玛公司合成。

1.2 细胞培养及干预 将HepG2细胞株置于含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM培养液中，于37℃、5%CO2条件下培养，实验时取处于对数生长期的细胞进行转染。将细胞按照每孔(0.5～1.0)×104/mL细胞浓度接种96孔板及每孔(1.0～1.5)×105/mL细胞浓度接种6孔板，于37℃、5%CO2孵箱培养至转染当天细胞融合率为30%～50%。将细胞随机分为转染组、阴性对照组及空白对照组，转染组、阴性对照组按照 Lipofectamine2000使用说明分别瞬时转染 EZH2 siRNA(序列为 5'-GGGAAAGUGUAUGAUAAAUTT-3')、FAM(序列为 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3')，转染6 h后更换培养液继续培养，24 h在荧光显微镜下可看到少许绿色荧光，48 h绿色荧光明显即转染成功。空白对照组不予任何干预。

1.3 观察指标

1.3.1 细胞增殖活性 转染后第24、48、72和96小时分别进行MTT检测。每孔加入10μL MTT溶液(5 mg/mL)，在细胞培养箱内继续孵育4 h后小心弃上清且加入DMSO溶解紫色结晶。用酶标仪于490 nm处测定吸光度。实验重复3次，取其均值，绘制生长曲线。

1.3.2 细胞周期 转染后48 h收集浓度1.0×106/mL单细胞悬液，PBS洗涤细胞1次，每管加入100μL Rnase A 37℃水浴30 min，再加入400μL PI染色混匀，4℃避光30 min。应用流式细胞技术分析各组细胞周期时相分布。实验重复3次，计算平均值。

1.3.3 细胞凋亡率 转染后48h用PBS洗涤细胞2次，离心2000r/min，5min，收集(1～5)×105/mL细胞，每管加入300μLBindingBuffer悬浮细胞，再加入5μLAnnexinV-FITC混匀，加入5μL的PropidiumIodide，混匀，室温，避光，反应15min。应用流式细胞仪检测各时段癌细胞凋亡分布。实验重复3次。

1.3.4 EZH2mRNA表达 各组细胞培养至48h后抽提总RNA，逆转录反应体系体积20μL，内含1 μg总RNA、5×RT缓冲液4μL、dNTPMixture(各10 μmol/L)2μL、RNA 酶抑制剂1 μL、Oligo(dT)(10 pmol/μL)1μL和逆转录酶1μL，其余以DEPC水补足;混匀后短暂离心，42℃ 60min，95℃ 10min逆转录成cDNA。以各组cDNA作为模板，于荧光定量PCR仪上进行qRealtime-PCR，根据相对定量2－△△Ct方法计算各组EZH2mRNA表达水平的相对比值。1.3.5 EZH2蛋白表达 收集培养48h后的各组细胞，抽提总蛋白，利用BCA试剂盒测定蛋白浓度，以每泳道20μg浓度的蛋白样品上样，SDS-PAGE电泳、转膜，经过封闭、一抗(兔抗人EZH2多克隆抗体1∶1000)孵育过夜、PBST洗膜、HRP标记鼠抗兔二抗(1∶5000)，室温1h，PBST洗膜等步骤后，曝光扫描图片。以β-actin作为内参照分析与EZH2条带灰度值的比值，检测EZH2蛋白表达变化。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，计量数据以¯x±s表示，组间比较采用方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，两组数据比较采用t检验，计数资料采用χ2检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖活性 转染组于48h出现细胞增殖活性受抑，72、96h抑制作用逐渐明显(图1)，与阴性对照组及空白对照组比较，P均＜0.01;阴性对照组与空白对照组各时点细胞增殖活性比较均无明显差异。未观察到各组细胞明显形态学改变。

图1 各组细胞增殖活性

2.2 细胞周期 转染48h后转染组G0/G1期细胞数为(77.7±4.3)%，S 期细胞数(12.25 ±1.2)%，阴性对照组G0/G1期细胞数为(64.89±3.5)%，S期细胞数(23.13±2.7)%，而空白对照组G0/G1期为(63.52 ±3.5)%，S 期为(24.09 ±3.2)%，转染组较阴性对照组及空白对照组G0/G1期细胞数明显增多，S期细胞数明显增少，P均＜0.01，阴性对照组与空白对照组细胞周期比较无明显差异。

2.3 细胞凋亡率 转染48h后转染组、阴性对照组与空白对照组凋亡率分别为(43.97±4.1)%、(22.03 ±1.3)%、(24.05 ±2.7)%，转染组与阴性对照组及空白对照组比较，P均＜0.01;阴性对照组与空白对照组比较无明显差异。

2.4 EZH2mRNA和蛋白表达 HepG2细胞转染48h后，转染组、阴性对照组与空白对照组EZH2 mRNA 表达水平分别为 0.98 ±0.03、1.44 ±0.30、2.11±0.35(图2)，转染组与阴性对照组及空白对照组比较，P均＜0.01;转染组、阴性对照组与空白对照组EZH2蛋白表达水平分别为0.35±0.12、0.90 ±0.27、0.95 ±0.30(图 3)，转染组与阴性对照组及空白对照组比较，P均＜0.05，阴性对照组与空白对照组EZH2mRNA和蛋白表达比较均无明显差异。

图2 各组细胞EZH2mRNA表达

图3 各组细胞EZH2蛋白表达

3 讨论

RNA干扰(RNAinterference，RNAi)指由非编码小分子 RNA(siRNA、microRNA)诱导的、通过靶向沉默基因mRNA正常表达来调控细胞的分裂行为，长度为21～24nt，经RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)催化形成RNA沉默复合物(RISCs)，并与靶基因mRNA碱基互补相结合，影响靶基因的翻译［5］。Cao等［6］认为 EZH2 作为 PcG 基因家族的核心成员，依赖EZH2蛋白完整的SET结构域对核小体组蛋白H3的27位赖氨酸进行甲基化修饰形成二甲基或三甲基(H3K27me2/me3)而发挥沉默下游目的抑癌基因如 E-cadherin、p16INK4α等的作用［7，8］。针对 EZH2在肿瘤发生、发展过程中的重要作用，目前研究已显示在膀胱癌、胃癌等肿瘤中利用RNAi技术可抑制肿瘤细胞的增殖及侵袭力［9，10］，并发现EZH2在不同肿瘤细胞中的促增殖能力可能存在差异。

已有研究显示EZH2在肝癌(HCC)组织中较癌旁及正常肝组织中表达明显增高［9］，本实验将EZH2 siRNA成功转染入HepG2细胞内沉默EZH2基因表达，结果显示随时间推移，肝癌细胞增殖呈明显抑制趋势，抑制效应于转染后48 h显现，并持续48 h以上，且细胞周期发生改变，多数细胞停滞于G0/G1期，细胞增殖活性下降，诱导凋亡增加;EZH2 mRNA和蛋白表达均呈现明显下调趋势，证实EZH2 siRNA具有抑制肝癌细胞中EZH2基因表达的作用。可见RNAi技术可成功干扰肝癌细胞株HepG2中EZH2表达，从而抑制肝癌细胞增殖，促进癌细胞凋亡。

细胞周期的调控失衡为肿瘤发生、发展的重要机制之一，是多基因突变、多环节失控的结果。G1/S期过渡阶段是细胞周期中较敏感的时期，易受外界因素的影响而发生异常，而pRB/E2F调节通路恰处于G1/S期调控的核心位置。在细胞周期G1期的早中期，去磷酸化的pRB结合于E2F的转录激活区，抑制E2F的转录活性，从而阻止了靶基因的转录;而当细胞进入G1后期时，去磷酸化的pRB被cyclinD/cdk4/cdk6催化并磷酸化，pRB磷酸化而释放出E2F，激活靶基因和细胞周期进程所需的诸多基因的转录［11］。EZH2的编码产物属于Polycomb抑制复合体2(PRC2/3/4)的成员，是转录因子E2F的靶基因［12］。E2F与 EZH2的启动子结合，导致EZH2高表达，并通过EZH2对核小体组蛋白H3的27位赖氨酸进行甲基化修饰，发挥沉默下游抑癌基因的作用，最终引起细胞周期调控失衡，促进细胞无规律增殖。因此，利用EZH2 siRNA沉默靶基因EZH2表达，抑制EZH2对下游抑癌基因的沉默作用，可影响肿瘤细胞的增殖与凋亡。

综上所述，EZH2在肝癌发生、发展中起重要作用，利用siRNA技术可抑制EZH2表达，从而抑制人肝癌细胞株HepG2增殖，此对肿瘤诊断、基因治疗有重要意义。

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