等位基因特异性PCR技术在5-脂氧合酶基因多态性检测中的应用

白春英，史铁伟，瑞 云，于晓明，张朝军，仝丽娟，李秀君，高丽枫，周 静

(1赤峰学院医学院，内蒙古赤峰 024000;2赤峰学院第一附属医院)

5-脂氧合酶(5-LO)是花生四烯酸代谢途径中非常关键的一个酶，研究发现该酶基因的多态性与哮喘病有关［1］。花生四烯酸的代谢产物白三烯(LTs)生物活性强烈、作用时间持久，可引起支气管痉挛、气道变应性炎症和气道高反应性。5-LO基因含有14个外显子，mRNA全长为2 560 bp，基因库中记载的单核苷酸多态性(SNPs)数多达36个。2012年，我们针对这36个SNPs在各个外显子中的分布特点，分别采用等位基因特异性 PCR(ASPCR)法对36例健康者的5-LO基因六个位点的SNPs进行了检测，现分析结果。

1 步骤

1.1 引物设计及基因组DNA提取 利用Taq酶缺乏3'-5'外切酶活性的特点(在突变型引物扩增正常DNA模板时，延伸反应会因磷酸酯键难于形成而不能进行，即得不到特异长度的条带，从而表明模板DNA无此突变;反之表明有突变产生)，将突变型引物和非突变型引物分别用于同一DNA模板扩增，判断有无特定位点基因的特定突变［2］。根据这一原理针对野生型和突变型设计3'端的碱基，一般倒数第二位的碱基设计故意错配的碱基，用以提高引物的特异性［3］。本研究设计的引物见表1。收集36例健康者的外周血标本2 mL，提取基因组DNA作为扩增反应的模板，具体方法见参考文献［4］。

1.2 PCR反应体系及反应条件 每个SNP位点用AS-PCR扩增检测时反应体系分为A管和B管，分别加入野生型和突变型引物，两管中均加入对照用一对引物和共用的右侧引物。本研究设计的对照用引物为EXON8的引物，左侧引物为5LOEX8S:5'aga ggc gaa gtt ctc caa ca;右侧引物为5LOEX8A:5'aac agg gac gga gag tga tg，PCR产物为600 bp，各反应体系见表2。例如，体系1和2是用于检测Ile293Val和Ala308Ser的，对于293位点来说，体系1就是A管，体系2就是B管;而对于308位点来说，体系2是A管，体系1是B管。同理，体系3和4是用于检测Ala447Ser和Pro504Leu的;体系5和6是用于检测Val542Leu和Ala549Val的。PCR反应条件:95℃预变性 5 min;95℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、1 min循环35次，末次循环后72℃延伸10 min，4℃保存。

表1 本研究设计的引物

1.3 PCR扩增结果 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 PCR扩增后取PCR产物10 μL，采用2%的琼脂糖凝胶电泳，鉴定 PCR扩增结果(取5 μL DNA markerI作为标记)。

表2 PCR反应体系

2 结果

琼脂糖凝胶电泳显示，PCR扩增后出现条带分别为 600、500、400、300、200、100 bp，见图1。

图1 5-LO等位基因特异性PCR产物电泳图

3 讨论

5-LO是花生四烯酸代谢途径非常关键的一个酶，白三烯是引起哮喘的主要炎性介质。5-LO抑制剂为治疗哮喘的新药，其作用机制为通过抑制5-LO的作用阻止下游产物白三烯的大量生成;检测哮喘患者的5-LO基因多态性，观察多态性对5-LO抑制剂的药物反应，对临床治疗哮喘有非常重要的意义。本研究采用的AS-PCR法可快速检测5-LO的SNP，并可快速直接进行分型，不需要测序和酶切，具有经济、快速、简便、易行等特点，特别适用于临床大批样本基因单个位点的研究。等位基因特异性PCR技术的关键在于引物设计，本研究采用自行设计的引物和检测条件，快速检测到了5-LO六个位点的SNPs，可为临床研究5-LO基因提供参考，并为哮喘的基因治疗提供依据。

［1］Chunying B，Eiko M，Hidenori O，et al.A novel polymorphism，E254K，in the 5-lipoxygenase gene associated with bronchial asthma［J］.Intern J Molec Med，2008，21:139-144.

［2］李春晓，张晓龙，曹晓梅，等.特异性等位基因PCR扩增技术检测家蝇击倒抗性相关钠通道的基因突变［J］.中国媒介生物学及控制杂志，2007，18(3):255-256.

［3］徐克前.分子生物学检验技术实验指导［M］.2版.北京:人民卫生出版社，2007:154-158.

［4］白春英，周静，瑞云，等.经济、有效提取全血基因组DNA的方法［J］.检验医学与临床，2010，7(17):1795-1798.