AE3通过NO通路参与心肌细胞缺氧预适应的保护作用

廖章萍，刘 丹，王淑霞，李文娟，陈和平，何 明

(1.南昌大学药学院药理学与分子治疗学教研室，江西南昌 330006;2.江西省人民医院，江西南昌 330046)

各种原因造成的心肌组织血液灌注量减少可使细胞发生缺血性损伤，恢复血液再灌注后，缺血性损伤不但没有缓解，反而进一步加重，这种现象称为心肌缺血/再灌注损伤。1986年 Murry等［1］发现，如预先反复短暂的缺血/再灌注则可延缓或减轻随后较长时间缺血所致的心肌损伤，并把此现象称之心肌缺血预适应。

心肌缺血/再灌注损伤会引起心肌细胞内pH值的变化，pH可调节多种细胞事件，包括离子通道传导、钙离子内环境稳态等，在心肌中，钙离子稳态及钙对肌丝的敏感性都受pH变化影响，pH也调节缝隙连接及心肌细胞电生理偶联。阴离子交换蛋白(anion exchanger，AEs)在调节细胞内酸碱平衡，维持细胞内pH值的稳定起着非常重要的作用。AEs是一种多功能嵌膜蛋白，具有Cl－/HCO3－交换功能，泵出 HCO3－，同时泵入 Cl－，使细胞内酸化［2］。

激活此离子交换系统，一方面，使细胞内Cl－浓度增加，另一方面，可使细胞内pH发生改变［3］。AEs包括AE1、AE2、AE3和AE4四个亚型，其中AE3在心肌中表达丰度最高。目前，关于AEs蛋白在心肌急性损伤病理生理过程的变化及其功能的研究很少，而有关AEs是否是通过细胞内某些信号转导途径发挥作用更是缺乏深入探讨。NO通路是近年来心肌细胞信号传导通路的研究热点，大量研究都已证实NO［4－6］参与了心肌细胞缺血缺氧预适应保护作用。故本实验采用Spraguer-Dawley(SD)乳鼠原代培养的心肌细胞，建立缺氧/复氧(A/R)和缺氧预适应(APC)模型，观察AE3蛋白在心肌细胞缺氧预适应保护中的意义及与NO信号转导通路的关系。

1 材料与方法

1.1 动物 SD新生大鼠(1～3 d)，♀♂不拘，由南昌大学医学院医学实验动物科学部提供。

1.2 药品与主要试剂 MEM培养基(Gibco)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，LNAME(L-N-Nitro-Arginine Methyl Ester):Sigma公司;MTT:Ameresco公司;乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸磷酸酶(CPK)试剂盒:Beckman公司;引物合成:上海生工生物工程技术服务有限公司;AE3抗体、β-actin抗体及相应二抗均购自Santa Cruz;总蛋白提取试剂盒:普利来公司。其余化学试剂均为国产分析纯。

1.3 心肌细胞的分离培养 参照陈杰等［7］方法。取出生1～3 d的SD大鼠，消毒后开胸取出心脏，分离心室组织，用0.1%胰酶消化分离心肌细胞，再加入含15%胎牛血清的MEM培养基混悬后置CO2培养箱(5%CO2，37℃)培养2 h，利用差速贴壁法去除成纤维细胞，将悬浮的心肌细胞用200目不锈钢网过滤，接种于相应的培养板内，于5%CO2，饱和湿度及37℃条件下培养，隔天更换培养液。

1.4 心肌细胞缺氧/复氧(anoxia/reoxygenation，A/R)模型建立 心肌细胞生长接近融合状态时，对培养心肌细胞换用预先经95%N2和5%CO2混和气体饱和过的模拟缺氧缺糖溶液(mmol·L－1，NaH2PO40.9，NaHCO36.0，CaCl21.8，MgSO41.2，HEPES 20，NaCl 98.5，KCl 10.0，pH 6.8，37℃)，置于持续95%N2－5%CO2平衡的A/R装置(37℃)中缺氧孵育3 h后，再换用模拟再灌注溶液(mmol·L－1，NaCl 129.5，KCl 5.0，NaH2PO40.9，NaHCO320，CaCl21.8，MgSO41.2，glucose 55，HEPES 20，pH 7.4)，37℃于95%O2－5%CO2复氧孵育2 h。

1.5 心肌细胞缺氧预适应(anoxia preconditioning，APC)模型建立 心肌细胞换预先经95%N2和5%CO2混和气体饱和过的模拟缺氧液，将细胞置于95%N2－5%CO2持续通气的缺氧密闭容器中(37℃)30 min，再换模拟再灌注液，以95%O2和5%CO2混合气体进行复氧孵育30 min(37℃)，重复3次。

1.6 实验分组 心肌细胞培养4 d后随机分组进行实验。实验共分4组，每组重复8次。① Control组:弃培养液，换用正常 Tyrode溶液置于培养箱(5%CO2、95%空气，37℃)孵育3 h后，再换上模拟再灌注溶液置于培养箱(5%CO2、95%空气，37℃)孵育2 h;②A/R组:弃培养液，换用模拟缺氧缺糖溶液将培养板置于持续95%N2、5%CO2平衡的缺氧密闭容器中(37℃)3 h，再换上模拟再灌注液，以95%O2、5%CO2混合气体进行复氧孵育 2 h(37℃);③ APC组:弃培养液，换用模拟缺氧缺糖液置于培养箱(5%CO2、95%空气，37℃)孵育30 min，再换模拟再灌注液，以95%O2和5%CO2混合气体进行复氧孵育30 min(37℃)，重复3次;然后进行A/R处理;④ L-NAME组:在APC处理前用终浓度为50 μmol·L－1NO合成酶抑制剂L-NAME与细胞孵育30 min后，余同APC组。

1.7 心肌细胞AE3 mRNA的检测 用TRIzol裂解心肌细胞提取RNA，经逆转录成cDNA，加入AE3和β-actin特异引物进行PCR扩增。AE3上、下游引物分别为:5'-AGGTCATGGAGCCCAATGG-3'，5'-GAACTTGATCCAGCGTG-3'。β-actin上下游引物分别为:5'-AAGGATTCCTATGTGGGC-3'，5'-CATCTCTTGCTCGAAGTC-3'。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，通过Image Tool图像分析软件读取目的电泳条带的密度扫描值，以各组β-actin条带的扫描值标化其相应组的AE3的mRNA表达量。

1.8 心肌细胞AE3蛋白的检测 按蛋白提取试剂盒的方法提取心肌细胞总蛋白，Bradford法蛋白定量后分装，－20℃保存。取上述细胞蛋白提取液上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，15%分离胶)，将电泳分离后的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，经封闭、洗脱后加入AE3抗体(1∶500)或βactin抗体(1∶200)，放置4℃过夜，洗膜后以相应的二抗孵育1 h，再洗膜，加ECL化学发光试剂，置暗室中曝光、显影、定影胶片。将X线胶片扫描后，在Image Tool医学图形分析软件上进行分析。将所得AE3蛋白带的综合密度分别除以β-actin相对应样本的综合密度。

1.9 细胞存活率检测 采取MTT比色法检测。培养于96孔培养板的H9c2心肌细胞，接种密度为104cells·well－1。实验处理后每孔加入MTT溶液(5 g·L－1)20 μl，孵育 4 h;每孔加入 150 μl DMSO振荡10 min，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值。设不加细胞，只加孵育液的空白对照，记录结果。细胞存活率/%=(实验组光吸收值/对照组光吸收值)×100%。

1.10 生化检测 实验结束后各组分别取孵育液200 μl，美国Beckman生化自动分析仪测定LDH和CPK活性。

2 结果

2.1 不同处理组对AE3 mRNA表达的影响 以各组β-actin条带的扫描值标化其相应组的心肌细胞AE3的 mRNA表达量，Control组、A/R组、APC组、L-NAME 组分别为 0.27±0.08、0.40±0.06、1.44±0.10、0.45±0.08。A/R 组 AE3 mRNA 转录较Control组增加(P＜0.05)。APC组心肌细胞AE3 mRNA不仅均较Control组转录明显上调，而且较A/R组也明显上调(P＜0.01)。但预先加入NO合成酶抑制剂L-NAME则抑制了APC处理时AE3 mRNA转录的增强(P＜0.01)(Fig 1)。

2.2 不同处理组对AE3蛋白表达的影响 以各组β-actin条带的扫描值标化其相应组的心肌细胞AE3的蛋白表达量，Control组、A/R组、APC组、LNAME组分别为 0.23±0.06、0.36±0.08、1.16±0.10、0.39±0.06。A/R组AE3蛋白表达较Control组增加。APC组心肌细胞AE3蛋白与A/R组比较也明显上调(P＜0.01)。而L-NAME则抑制了APC组AE3蛋白的上调(P＜0.01)。这一结果与上述心肌细胞AE3 mRNA的变化基本吻合(Fig 2)。

Fig 1 Effect of various treatments on expression of AE3 mRNA of cultured cardiomyocytes

Fig 2 Effect of various treatments on expression of AE3 protein of cultured cardiomyocytes

2.3 不同处理组对心肌细胞A/R损伤后LDH、CPK活性的影响 如Fig 3所示，与Control组比，A/R组细胞悬液中LDH及CPK活性分别增加至4.5、4倍(P＜0.01)。经APC处理则能降低 LDH及CPK活性(P＜0.01);但加入L-NAME则可取消APC的保护作用，LDH及CPK活性与A/R组无差异。

2.4 不同处理组对心肌细胞A/R损伤后细胞存活率的影响 MTT结果(Fig 4)显示，经A/R处理后，H9c2心肌细胞严重受损，细胞存活率较Control组降低47%;APC则能防止细胞损伤，细胞存活率上升至88%，较A/R组增高;而L-NAME可取消APC的心肌保护作用。

Fig 3 Effect of various treatments on LDH and CPK activity in cultured cardiomyocytes subjected to A/R injury

Fig 4 Effect of various treatments on cell viability in cultured cardiomyocytes subjected to A/R injury

3 讨论

大量研究发现心肌缺血/再灌注损伤、缺血预适应保护作用与心肌细胞内的Na+、K+、Ca2+等阳离子稳态的变化密切相关，然而，对于阴离子转运的有关研究却很少。心肌细胞内的阴离子包括 Cl－、SO4

2－、HPO4

2－、有机酸根离子等，其中 Cl－为主要通透性的阴离子，参与了细胞多种活动和功能调节过程，如细胞电活动调节、容积调节、细胞内pH值调节等，且在细胞免疫应答、细胞迁移、细胞增殖和分化及细胞凋亡中发挥一定的作用［8］。

本实验室前期研究发现Cl－在心肌细胞缺氧/复氧损伤中发挥重要作用，使用氯离子通道阻断剂SITS可对抗心肌细胞缺氧/复氧损伤，有明显的保护作用［7］。心肌缺血/再灌注时Cl－浓度的变化与细胞内pH值变化密切相关。AEs蛋白既是心肌细胞pH调节的主要方式之一，也是细胞内的Cl－浓度调节的重要通道蛋白之一。AEs具有双向转运Cl－/HCO－的功能，正常情况下其将细胞内HCO－33排出，同时将胞外Cl－移入胞内，使细胞酸化［9］;反之，也可反向转运Cl－和HCO3－［10］。心脏 AEs的膜性分布允许心肌细胞精确调节细胞内pH，防止代谢性CO2水化产生的HCO3－局部聚集，这对于心肌细胞维持正常的兴奋－收缩偶联及心脏舒缩功能具有非常重要的意义。新近研究亦证明，在肥厚性心肌病模型上，AE3蛋白的缺失可迅速导致失代偿及心力衰竭［11］。

本实验发现经缺氧预处理后，AE3 mRNA转录和蛋白表达均明显上调，提示AE3可能参与了预适应保护，是一种内源性保护蛋白。我们认为，当心肌细胞经过短暂的缺氧处理后，导致心肌细胞内ATP不足、ADP积聚、pH值降低，可能通过某种途径激活AE3蛋白，AE3蛋白发挥其双向转运功能，反向转运Cl－和HCO3－，减轻心肌细胞内的酸中毒，使心肌细胞的酸碱缓冲容量扩大，调节细胞内pH值在相对恒定的范围，以维持心肌收缩力。

本实验中，在心肌缺氧预处理前给予NO合成酶抑制剂L-NAME可抑制AE3 mRNA和蛋白表达的上调，并且取消了缺氧预处理的保护作用，说明预适应引起的AE3表达增加与NO通路有关。大量研究表明，NO在缺血预适应中发挥着重要的作用。短暂多次的缺血/再灌注可通过提高NO合成酶活性，从而促使NO合成增加，激活PKC，导致内源性保护基因转录的增加以及蛋白表达的上调，从而发挥调节微血管舒张、减轻氧化应激，减少心律失常发生的心肌保护作用［6］。给予NO受体激动药同样也能产生类似缺血预适应的保护作用［12］，而抑制NO的合成释放则可取消预适应保护［13］。

因此，结合本实验结果，我们推测AE3可能就是预适应保护物质的一种。缺氧预处理通过激活NO通路，使得AE3表达增加，AE3蛋白发挥其双向转运功能，反向转运Cl－和HCO3－，减轻心肌细胞的酸中毒，发挥心肌保护作用。

［1］ Murry C E，Jennings R B，Reimer K A.Preconditioning with ischemia:a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium［J］.Circulation，1986，74(5):1124 －36.

［2］ van den Akker E，Satchwell T J，Williamson R C，Toye A M.Band 3 multiprotein complexes in the red cell membrane;of mice and men［J］.Blood Cells Mol Dis，2010，45(1):1 －8.

［3］ Chiappe de Cingolani G E，Ennis I L，Morgan P E，et al.Involvement of AE3 isoform of Na+-independent Cl－/HCO3－exchanger in myocardial pH(i)recovery from intracellular alkalization［J］.Life Sci，2006，78(26):3018 －26.

［4］ Liao Z，Yin D，Wang W，et al.Cardioprotective effect of sasanquasaponin preconditioning via bradykinin-NO pathway in isolated rat heart［J］.Phytother Res，2009，23(8):1146 －53.

［5］ Talukder M A，Yang F，Shimokawa H，Zweier J L.eNOS is required for acute in vivo ischemic preconditioning of the heart:effects of ischemic duration and sex［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2010，299(2):H437 －45.

［6］ Weerateerangkul P，Chattipakorn S，Chattipakorn N.Roles of the nitric oxide signaling pathway in cardiac ischemic preconditioning against myocardial ischemia-reperfusion injury［J］.Med Sci Monit，2011，17(2):RA44 －52.

［7］ 陈 杰，刘 丹，陈和平，等.氯离子参与心肌细胞缺氧复氧损伤机制的研究［J］.中国药理学通报，2007，23(6):724 －9.

［7］ Chen J，Liu D，Chen H P，et al.Mechanisms of chloride in anoxiareoxygenation injury of cultured rat ventricular myocytes［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(6):724 －9.

［8］ Zifarelli G，Pusch M.CLC chloride channels and transporters:a biophysical and physiological perspective［J］.Rev Physiol Biochem Pharmacol，2007，158:23 －76.

［9］ Bonar P T，Casey J R.Plasma membrane Cl－/HCO3－exchangers:structure，mechanism and physiology［J］.Channels(Austin)，2008，2(5):337 －45.

［10］ Ohana E，Yang D，Shcheynikov N，Muallem S.Diverse transport modes by the solute carrier 26 family of anion transporters［J］.J Physiol，2009，587(Pt 10):2179 －85.

［11］ Al Moamen N J，Prasad V，Bodi I，et al.Loss of the AE3 anion exchanger in a hypertrophic cardiomyopathy model causes rapid decompensation and heart failure［J］.J Mol Cell Cardiol，2011，50(1):137－46.

［12］ Cohen M V，Yang X M，Liu Y，et al.Cardioprotective PKG-independent NO signaling at reperfusion［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2010，299(6):H2028 －36.

［13］ Pagel P S，Krolikowski J G，Pratt P F Jr，et al.The mechanism of helium-induced preconditioning:a direct role for nitric oxide in rabbits［J］.Anesth Analg，2008，107(3):762 －8.