小剂量氯胺酮对吗啡耐受细胞δ阿片受体及NMDA受体2B亚型表达的影响

张秀宁，文 迪，徐贯杰，孟雁欣，丛 斌，赵申明，马春玲

(1.河北医科大学第三医院麻醉科，河北石家庄 050051;2.河北医科大学基础医学院法医学系，河北省法医学重点实验室，河北石家庄 050017)

吗啡(morphine，Mor)广泛用于疼痛治疗，尤其是晚期癌痛患者，但长期应用可产生吗啡耐受影响其镇痛效果，其机制可能与阿片受体脱敏和内化有关［1－2］。NMDA受体高表达在吗啡耐受中亦发挥重要作用［3］。发现 NMDA受体拮抗剂氯胺酮(ketamine，K)等具有缓解吗啡耐受的作用已近20年，临床研究［4］与动物研究［5－6］关于小剂量氯胺酮防止吗啡耐受发生有大量报道，然而此作用的分子机制迄今尚未阐明。本研究拟在建立吗啡耐受细胞模型基础上，通过观察小剂量氯胺酮对δ阿片受体1(DOR-1)和NMDA受体2B亚型(NR2B)的影响，初步探讨氯胺酮调节吗啡耐受的受体机制。

1 材料与方法

1.1 材料 PC-12(上海拜力生物科技有限公司)，DMEM/高糖培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清、青/链霉素、EDTA-胰酶(美国 PA公司)，盐酸吗啡注射液(沈阳第一制药厂)，盐酸氯胺酮注射液(福建古田药业有限公司)，TRIzol(美国 Invitrogen公司)，DEPC(美国 Invitrogen公司)，PrimeScriptTMRT regent Kit、SYBR Premix Ex TaqTMPCR 试剂盒(日本TaKaRa公司)，LanceTM384cAMPKit(美国PerkinElmer公司)，PCR 仪、7500型 Real-Time PCR仪(美国AB公司)，多功能酶标仪(瑞士Tecan公司)。

1.2 细胞培养及吗啡耐受细胞模型建立 PC-12细胞接种于含10%胎牛血清、1×105U·L－1青霉素、1×105U·L－1链霉素的DMEM/高糖培养基中，在37℃下持续通入5%CO2和95%空气进行培养。将细胞按4×108cells·L－1的密度接种在50 ml培养瓶中，置培养箱中培养24 h后更换培养基，48 h后细胞贴壁面积约80% ～90%，细胞传代于6孔板，细胞密度2×108cells·L－1，每孔2 ml培养基，于培养箱中培养24 h，细胞贴壁面积约70%，更换为不含胎牛血清的培养基，加入不同因素进行处理。

参照文献［7］建立吗啡耐受细胞模型，加入10 μmol·L－1吗啡作用48 h，以cAMP含量增加检验模型建立是否成功。

1.3 cAMP含量测定 10 μmol·L－1吗啡分别作用细胞0.5、6、24和48 h，1 ×PBS冲洗细胞2 次，加入 Versene's 液(g·L－1，EDTA 0.37，NaCl 8.00，KCl 0.20，KH2PO40.20，Na2HPO41.15，葡萄糖 0.20，pH 7.4)，室温孵育3～5 min后收集细胞，4℃、300×g离心5 min，弃上清。1×HBSS液(g·L－1，CaCl20.14，KCl 0.40，KH2PO40.06，MgCl2·6 H2O 0.10，MgSO4·7 H2O 0.10，NaCl 8.00，NaHCO30.35，葡萄糖1.00，Na2HPO4·7 H2O 0.09，pH 7.4)冲洗1 次，1×HBSS液重悬细胞并计数，调整细胞浓度为2×109cells·L－1。使用时间分辨荧光免疫分析cAMP试剂盒测定细胞内cAMP含量。

1.4 DOR-1和NR2B表达测定 应用Real-Time PCR检测PC-12细胞DOR-1和NR2B表达:1×PBS冲洗细胞两次，加入TRIzol提取细胞总RNA，各组取500 ng总RNA经PrimeScriptTM反转录试剂盒合成 cDNA，反转录程序:37℃ 15 min，85℃ 5 s.Premix Ex TaqTM试剂盒扩增目的基因，所用引物由上海生物技术工程公司合成。引物序列:DOR-1(上游 5'-CAACGTGCTCGTCATGTTTGG-3'，下 游 5'-CAGGTACTTGGCGCTCTGGAA-3');NR2B(上游5'-TGCACAATTACTCCTCGACG-3'，下 游 5'-TCCGATTCTTCTTCTGAGCC-3');GAPDH(上游5'-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3'，下 游 5'-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3');扩增条件:95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，45个循环。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳验证。GAPDH基因为内参基因。△△Ct法分析目的基因相对表达量。

2 结果

2.1 吗啡镇痛/耐受PC-12细胞模型的建立 参照文献［7］成功建立吗啡耐受细胞模型，以10 μmol·L－1吗啡处理 PC-12 细胞 0.5、6、24、48 h 后测量细胞内cAMP含量。处理0.5 h组细胞内cAMP含量(2.23±0.26)pmol·L－1明显低于对照组(3.05±0.32)pmol·L－1(P=0.008)。48h 组细胞内cAMP含量(3.86±0.29)pmol·L－1高于对照组(P=0.021)。6 h 组(2.94 ±0.76)pmol·L－1和 24 h组(3.10 ±0.42)pmol·L－1，与对照组相比差异均无显著性(P=0.698和P=0.868)。见Fig 1。

2.2 不同剂量氯胺酮作用PC-12细胞48 h cAMP含量 不同剂量氯胺酮(0.5、5、50 μmol·L－1)组cAMP含量(3.32±0.50)、(3.22±0.30)、(3.25±0.25)pmol·L－1与对照组(3.31 ±0.40)pmol·L－1相比差异无显著性(P=0.99、P=0.73、P=0.81)，见Fig 2。

2.3 氯胺酮联合吗啡作用细胞48 h cAMP含量10 μmol·L－1吗啡单独作用 cAMP 含量(4.53 ±0.40)pmol·L－1高于对照组(3.73 ± 0.25)pmol·L－1(P=0.005)。吗啡与 0.5 μmol·L－1氯胺酮联合作用cAMP含量(2.86±0.18)pmol·L－1明显低于对照组(P=0.013)和吗啡组(P=0.001)。吗啡与5、50 μmol·L－1氯胺酮联合作用 cAMP 含量分别为(3.44 ±0.33)pmol·L－1和(3.64 ±0.35)pmol·L－1，均明显低于吗啡组(P=0.002，P=0.006)，与对照组相比差异无显著性(P=0.478，P=0.938)，见Fig 3。

Fig 1 cAMP levels in PC-12 cells treated with 10 μmol·L-1morphine for different times

Fig 2 cAMP levels in PC-12 cells treated with different concentrations of ketamine for 48 hours

2.4 吗啡耐受细胞模型DOR-1的表达 应用Real-Time PCR检测细胞DOR-1受体表达，结果显示:吗啡作用细胞48 h后与对照组相比表达下降(0.55±0.11)倍(P=0.005)，单独应用 0.5 μmol·L－1氯胺酮组(0.98±0.82)与对照组相比差异无显著性(P=0.99)，与对照组相对表达值为0.98±0.82。0.5 μmol·L－1氯胺酮与 10 μmol·L－1吗啡联合作用(1.03±0.02)与吗啡组(0.55±0.11)相比DOR-1表达明显增高(P=0.003)，与对照组相比差异无显著性(P=0.840)，见Fig 4。

Fig 3 cAMP levels in PC-12 cells treated with 10 μmol·L-1morphine(Mor)in the presence and absence of different concentrations(K，μmol·L-1)of ketamine for 48 hours

Fig 4 Level of DOR-1 expression in PC-12 cells treated with 10 μmol·L-1morphine(Mor)，0.5 μmol·L-1ketamine(K)，and 10 μmol·L-1morphine plus 0.5 μmol·L-1ketamine

2.5 吗啡耐受细胞模型NR2B的表达 应用Real-Time PCR 检测 NR2B 表达结果显示，10 μmol·L－1吗啡作用细胞48 h，NR2B表达(18.09±3.69)较对照组(1.00±0.01)增高(P=0.016)，单独应用0.5 μmol·L－1氯胺酮组(1.36 ±0.61)与对照组相比差异无显著性(P=0.99)。吗啡联合应用0.5 μmol·L－1氯胺酮组NR2B表达(2.49±0.83)与吗啡组相比明显降低(P=0.017)，与对照组相比差异也有显著性(P=0.042)，见 Fig 5。

3 讨论

吗啡是目前临床癌痛患者常用的镇痛药，但长期应用易产生耐受而严重影响其镇痛效果。在单独使用吗啡无效的癌痛患者中，辅以小剂量(肌注小于2 mg·kg－1、静脉或硬膜外注射小于 1 mg·kg－1或静脉持续输注≤20 μg·kg－1·min－1)氯胺酮治疗，可使62%的患者得到长达8周的疼痛改善［8］，而小剂量氯胺酮本身无明显镇痛作用。其相关分子机制尚不清楚，尤其NMDA受体亚单位和阿片δ受体在其中的相关作用报道甚少。

Fig 5 Level of NR2B expression in PC12 cells treated with 10 μmol·L-1morphine(Mor)，0.5 μmol·L-1ketamine(K)，and 10 μmol·L-1morphine plus 0.5 μmol·L-1ketamine

目前，普遍认为吗啡与阿片受体结合，主要通过抑制AC-cAMP信号转导通路产生镇痛作用［9］，吗啡长时程处理导致抑制作用降低，引起细胞内AC-cAMP通路适应性上调，cAMP含量增加，因此通常以cAMP是否明显增加作为吗啡耐受细胞模型建立的依据［9－10］。本实验以10 μmol·L－1吗啡处理 PC-12细胞48 h后cAMP含量明显升高，提示吗啡耐受细胞模型建立成功。

阿片受体主要包括μ、δ、κ等亚型，有研究表明［11］，将小鼠δ受体1(DOR-1)基因外显子敲除后，应用DOR特异受体激动剂D青霉胺2、D青霉胺5内啡肽(［D-Pen2，D-Pen5］enkephalin，DPDPE)进行镇痛测试，结果显示DPDPE耐受缺失，表明阿片耐受形成与DOR-1相关。而小剂量氯胺酮防止吗啡耐受发生是否和DOR-1相关未见报道，本实验结果证实吗啡耐受细胞DOR-1表达较对照组下降，而小剂量氯胺酮与吗啡联合作用可防止DOR-1的下调，提示小剂量氯胺酮可通过调节DOR-1表达缓解吗啡耐受。

NMDA受体是谷氨酸特异性离子通道受体，由NR1、NR2(A、B、C、D)和 NR3(A、B)组成［12］。氯胺酮是非特异性NMDA受体拮抗剂，Bajo等［13］发现吗啡耐受SD大鼠中，脑伏核和中央杏仁核NR1和NR2B表达升高，而NR2A表达无变化，表明吗啡长时程作用引起耐受过程有NMDA受体参与，但各亚单位作用不同，且NR2B在伤害性感受发生和维持中有重要作用［12］。本实验研究发现吗啡耐受发生时NR2B表达上调，与 Bajo等［13］在体研究结果一致，而小剂量氯胺酮与吗啡联合作用可使上调的NR2B下降，提示小剂量氯胺酮可通过调节NR2B表达缓解吗啡耐受。

以往对DOR-1和NR2B在小剂量氯胺酮抑制吗啡耐受机制的研究多在整体水平进行，本实验首次在细胞水平同时观察DOR-1和NR2B在此过程的变化，为进一步探讨其受体后信号传导机制提供了实验依据。综上，小剂量氯胺酮可防止吗啡镇痛耐受发生，其受体机制可能与阻止吗啡引起的细胞DOR-1表达下调及NR2B表达上调有关。

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