三种检测方法在疟疾诊断和疗效中的应用评估

焦炳欣 华文浩 陈志海 李兴旺 杨晓玲 何艳群 周 淳 周 茹 郭 杰

首都医科大学附属北京地坛医院，北京 100015

疟疾是由疟原虫感染引起的危害严重的寄生虫病，我国曾将疟疾发病控制在较低水平[1]，2000年以来，疟疾疫情出现回升，目前防治工作依然十分严峻。因此，及时、准确的诊断对有效治疗疟疾及控制其流行具有重要意义[2]。本研究通过对疑似疟疾患者血样用镜检法、OptiMAL法和实时荧光定量PCR法进行疟原虫的检测，并将快速免疫层析法和实时荧光定量PCR法与传统镜检法做比较，旨在探讨疟原虫对抗疟药体外敏感性监测的方法，为指导临床抗疟药的合理使用提供支持和依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源

67份血样来自2010年1月～2012年3月来我院就诊的疟区发热患者。每份血样分别涂制厚薄血片后留存血样，-20℃低温保存。样本采集均为静脉取血，2%EDTA-Na2抗凝。

1.2 仪器与试剂

ABI PRISM7300实时荧光定量PCR仪 （美国ABI公司）。疟原虫核酸测定试剂盒。恶性、间日疟、卵形疟原虫核酸测定试剂盒（上海之江生物科技股份有限公司）。单克隆抗体免疫层析试剂盒（OptiMAL-IT）（瑞士DiaMed生物医药公司）。

1.3 方法

1.3.1 镜检方法

每份血样均涂制厚薄血膜各1张，吉氏染色。高倍镜下观察血涂片，并计数虫体密度。疟原虫的密度＝疟原虫数÷白细胞数×患者每微升血中白细胞数。

1.3.2 单克隆抗体免疫层析试剂盒OptiMAL法（以下称OptiMAL法）

将患者全血点样到试剂盒的点样孔上，样品将沿纤维膜向上移动，如样品中含有恶性虐乳酸脱氢酶或者其他疟疾乳酸脱氢酶，将会与特定位置的单克隆抗体结合并发出颜色，结果的判断标准为仅在控制线处出现反应带表明实验成功且为阴性，在控制线和疟疾反应带处同时出现反应为疟疾阳性。

1.3.3 荧光定量PCR方法

参照疟原虫核酸测定试剂盒说明书进行，试剂盒采用聚合酶式反应（PCR）技术结合荧光探针技术，对疟原虫特异性核酸片段进行荧光PCR检测。

1.3.3.1 疟原虫DNA提取 全血标本取100 μL（震荡混匀10 s）分别加入100 μL核酸提取液，震荡10 s，99℃干浴10 min，13000 r/min离心10 min，保留上清备用。同时将阳性对照品进行10、100、1000倍梯度稀释，备用。

1.3.3.2 荧光定量PCR检测 荧光反应管置于定量荧光PCR仪上，循环参数设 37℃×2 min；94℃×2 min；再按 93℃×15 s→60℃×60 s，循环40次；单点荧光检测在60℃。反应体系为40 μL。上机进行扩增。

1.3.3.3 DNA含量的测定 实验结束仪器根据其浓度自动生成标准曲线。循环阈值（Ct值）与起始模板量呈直线负相关。根据检测样品的Ct值，即能求出起始DNA的含量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行数据分析，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三种不同方法检出率比较

67例疑似疟疾来我院就诊的患者中，镜检检出疟原虫38例 （56.7%）；OptiMAL法检出疟原虫35例 （52.2%），PCR法检出疟原虫42例（62.7%）；经卡方检验，3种检测方法定性判断结果之间差异无统计学意义（P=0.471）。

2.2 临床特征结合实验室与PCR技术检出率比较

在上述疟疾阳性患者中，经临床特征结合实验室检测确诊28例为恶性疟，14例为间日疟，PCR技术检出恶性疟28例，间日疟14例，符合率为100%。

2.3 三种方法的分析性能评价

以临床诊断为标准，对检测疟原虫3种方法的分析性能进行评价。见表1。

表1 三种方法的分析性能评价（%）

2.4 OptiMAL法治疗效果的考核

28例恶性疟和14例间日疟患者经常规治疗24 h、3 d、1周后分别采血考核治疗效果，治疗3 d后部分患者阴转，但治疗1周后所有患者均表现为阴性，表明未出现耐药株（图1）。

图1 疟疾患者服药后24 h、3 d和1周用OptiMAL法考核效果

2.5 镜检法（虫体密度/μL）治疗效果考核

42例疟疾患者在治疗前，治疗后24 h、3 d、1周和2周后疟原虫的虫体密度分别为 6.1×105/μL，9.2×105/μL，100/μL<50/μL（阴性），<50/μL（阴性）。

2.6 PCR法治疗效果的考核

监测42例疟疾患者治疗前，治疗后24 h、3 d、1周和2周后疟原虫的核酸含量分别为 2.7×107、2.1×105、4.27×103、2.92×102、33 copies/mL。患者血中核酸含量伴随病情逐渐好转呈下降趋势，可作为停药的依据。

3 讨论

检出疟原虫是疟疾明确诊断的最直接证据。目前最常用的是显微镜检查法，但由于疟区人群普遍服用抗疟药物而影响了原虫正常形态[3]，造成对外周血疟原虫有很强的抑制作用；同时低原虫血症和混合感染患者的增多使传统的疟疾诊断方法不能适应现代疟疾监控的要求，一些对传统方法的改进及新的诊断技术应运而生。目前疟疾的监测方法包括病原学诊断即显微镜厚/薄血片的检查、免疫学检查即快速免疫诊断试条和病原基因诊断[4]即实时定量PCR法等。

实验结果表明，3种方法对疟疾阳性检出率无显著差异，但PCR法敏感性最高。据文献报道：PCR检测的敏感度可达1个原虫/μL；镜检法最低检出限为3～4个/万红细胞，而OptiMAL法最低检出限为10～20个/L血（含350万～600万红细胞）[5]，在本研究中，当原虫密度较低（<50/μL）时，即在疟疾处于较低水平的原虫血症时，靠镜检法难以查到，容易出现漏诊，而用PCR法可弥补这一不足。

实验结果表明，疟原虫3种检测方法的特异性无明显差异。但检测中有两例镜检法为阴性，而OptiMAL法与PCR法检测结果一致，均为阳性。原因可能是疟原虫在药物治疗前，在红细胞中形态完整，且有一定的密度，镜检法可检出；一旦药物治疗后，疟原虫被裂解、破坏、分解，其形态遭到破坏，此时用染色镜检法很难诊断，而以分子形式存在血液中的乳酸脱氢酶则仍可被检出，直至血液中的疟原虫乳酸脱氢酶被分解代谢。

OptiMAL法的原理是利用乳酸脱氢酶（LDH）单克隆抗体捕获溶血中的LDH抗原的免疫层析技术[6-7]。由于血液中LDPH与虫体血症呈平行相关，同时疟原虫乳酸脱氢酶作为原虫的一种特殊形式的循环抗原与人红细胞和其他物质的乳酸脱氢酶具有显著不同的物理生化特性，易于区分，可作为疟原虫存在的标志物。从表中可知疟原虫患者在治疗3 d部分患者出现阴转，但治疗1周后所有患者均表现为阴性反应。原因是OptiMAL法可反映药物治疗后原虫数量的下降，检测同种或异种疟原虫的重复感染及疟疾复燃情况，同时由于死亡的疟疾不能分泌LDH[8-9]，因此能够考核治疗效果和鉴定抗药株的出现。但由于是定性实验，不能作为停药的依据。

定量PCR的优势在于解决了对疟原虫密度的快速简便和准确的获取，量化相同虫种不同基因型混合感染的情况，动态观察疾病发展状况。从表1中可知，随着治疗天数的增加，患者DNA拷贝数逐渐减少，两周后PCR法转阴，可作为停药的依据。

本研究表明，OptiMAL法和PCR法作为镜检法的补充，OptiMAL法中LDPH具有很好的特异性，在疟疾得到治疗后，其PLDH能快速从血液中清除，从而避免因循环抗原长期存在所造成的假阳性而导致滥用药物，考核治疗效果，更适应大规模流行区域的需要，PCR法在低原虫血症、虫体的鉴别和是否继续用药方面具有非常重要的实用价值。

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