青蒿素对大鼠心肌梗死后心肌纤维化的影响及其机制

顾永伟 王 晞 党 松 胡 娟 王 鑫 熊 亮 朱 丹

武汉大学人民医院心内科，湖北 武汉 430060

心肌梗死后会诱导一系列炎症反应，炎症介质会促进心室重构的发生，主要表现为心肌纤维化，纤维化直接导致心脏舒张功能减弱，从而进展为心力衰竭[1-2]。

青蒿素是一种菊科植物黄花蒿叶中提取分离到的一种具有过氧桥的倍半萜内酯类化合物，具有抗疟疾、抗增殖、抗纤维化、抗心肌肥大的作用[3-4]。但是，青蒿素对心肌梗死后纤维化的影响及其机制目前尚不清楚。本实验旨在观察青蒿素对大鼠心肌梗死后心功能的影响以及对心肌纤维化相关因子，如转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和Ⅰ型胶原（collagen typeⅠ）表达的影响，从而探讨青蒿素对心肌梗死后心肌纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组及模型制作

成年SD雄性大鼠，体重200～250 g（华中科技大学同济医学院动物中心提供）。大鼠采用3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉成功后将大鼠固定在手术台，剪开颈部皮肤分离气管，行气管插管，同时将气管插管针与小动物呼吸机连接。切开胸部皮肤分离胸大肌，剪开第2根肋骨，将心脏暴露，在肺动脉圆锥和左心耳之间结扎冠状动脉。结扎成功后缺血区心肌组织变白，同时心电图对应的导联抬高。假手术组只进行开胸和分离冠状动脉但是不结扎。术后24 h将心肌梗死模型制备成功的大鼠随机分为对照组和青蒿素组。青蒿素组按照75 mg/(kg·d)剂量灌胃，每日3次。对照组和假手术组灌胃等量的0.5%羧甲基纤维素钠溶液，治疗4周后检测心功能和纤维化相关指标。

1.2 超声心动图和血流动力学检测

心肌梗死后4周利用超声心动图检测心脏结构和功能的变化。超声检查前，每只大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）进行麻醉，然后检测乳头肌水平胸骨旁短轴切面，分别测量左心室舒张末期内径 （left ventricle end diastolic dimension，LVEDD）、左心室收缩末期内径（left ventricle end systolic dimension，LVESD）、左心室射血分数（eject fraction，EF）以及左心室短轴缩短率（fractional shortening，FS）。血流动力学检测时，将微导管从大鼠右颈总动脉插入左心室，同时记录左心室收缩末压 （left ventricular end-systolic pressure，LVESP）和左心室舒张末压（left ventricle end-diastolic pressure，LVEDP）以及压力上升最大速率（dp/dtmax）。

1.3 免疫组织化学分析心肌梗死面积和心肌纤维化

心肌梗死后4周，取出大鼠心脏放入10%浓度的福尔马林溶液中固定，取左心室长轴以下部分石蜡包埋，切取4 μm厚的截面标本行Mallory-Azan染色，用图像分析软件测定梗死面积并取均值。Mallory-Azan染色切片用来定量测定血管周围心肌纤维化面积，每个心脏取10个视野然后取其平均值。

1.4 Western blot检测TGF-β1和collagen typeⅠ蛋白表达

分别取梗死边缘区和假手术组对应区心肌组织提取蛋白。各取等量的蛋白样品，加入10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，然后通过电转将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，将膜置入10%脱脂奶粉中室温封闭20 min，再加入1∶1000稀释的一抗（TGF-β1兔抗鼠和collagen typeⅠ兔抗鼠），4℃孵育过夜。TBST洗涤3次后加入1∶20的二抗37℃孵育1 h，然后再用TBST洗膜3次。将膜同ECL反应，1～5 min后曝光于X光胶片上。通过光密度软件分析，将目的条带值与β-actin值比较，相对值为TGF-β1和collagen typeⅠ蛋白表达水平。

1.5 统计学方法

采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物生存率和心肌梗死面积比较

心肌梗死后4周，假手术组生存率显著高于对照组和青蒿素组；与对照组比较，青蒿素组生存率显著提高（65%vs 40%，P＜0.05）；对照组与青蒿素组大鼠心肌梗死面积差异无统计学意义[（41.00±4.40）%vs （38.38±4.36）%，P ＞ 0.05]。

2.2 超声心动图和血流动力学检查结果

心肌梗死后4周，对照组和青蒿素组LVEDP、LVESD、LVEDD与假手术组比较显著增加，而FS和dP/dtmax则显著降低，表明心肌梗死模型制备成功。青蒿素治疗组与对照组比较，LVEDP、LVESD、LVEDD 显著缩小，而 FS 和 dP/dtmax显著增加（P<0.05）。 见表 1。

2.3 梗死周边区心肌纤维化变化情况

梗死周边区心肌纤维化导致心肌僵硬舒张功能减弱，恶化心功能。本研究通过对组织切片行Mallory-Azan染色，然后定量分析，发现青蒿素治疗组和对照组的血管周围纤维化范围与假手术组比较显著增加（P<0.05），但是青蒿素治疗组与对照组比较显著减轻（P<0.05）。见图1。

2.4 梗死周边区心肌组织TGF-β1和collagen typeⅠ蛋白表达情况

心肌梗死后4周发现，对照组和青蒿素组TGF-β1蛋白表达与假手术组比较显著增高（P<0.05），而青蒿素组TGF-β1和collagen typeⅠ蛋白表达水平显著低于对照组（P<0.05）。见图2。

表1 超声心动图和血流动力学检测（）

表1 超声心动图和血流动力学检测（）

注：与假手术组比较，#P＜0.05；与对照组比较，&P＜0.05；1 mm Hg=0.133 kPa

图1 心肌梗死后4周，血管周围纤维化面积定量分析

3 讨论

本研究发现青蒿素具有抑制心肌梗死后心室重构改善心功能提高生存率的作用。青蒿素对心肌梗死后心脏的保护作用主要通过抑制心肌梗死后的炎症因子的表达、心肌纤维化的进程，从而缓减心室重构。

心肌梗死后伴有心室重构的发生，其中包括左室腔的扩大和功能的改变。心室重构是一个慢性进展性过程，其中包括非梗死区心肌细胞的肥大、细胞外基质合成增加、心肌间质纤维化程度的加剧，最终导致心室腔的扩大[5]。这种病理性重构导致心脏功能障碍，已成为心肌梗死后患者致残和致死的独立危险因素[6]。本实验笔者通过建立大鼠心肌梗死模型观察青蒿素对大鼠心肌梗死后心功能以及生存率的影响。青蒿素治疗4周后笔者发现，青蒿素组与对照组比较生存率和心功能显著增加（P<0.05），心脏结构重构得到显著缓减。研究结果表明，青蒿素具有潜在抑制心肌梗死后心室重构的作用。

图2 Western blot分析梗死周边区心肌组织TGF-β1及collagen typeⅠ的表达水平

心肌梗死后坏死的细胞诱导炎症反应产生大量的炎症因子，这些炎症因子促进心肌纤维化，加剧心室重构。NF-κB是调控炎症反应的关键转录因子[7]。心肌梗死后NF-κB信号通路被激活，诱导炎症反应，释放大量炎症因子，如TGF-β1。TGF-β1在心肌纤维化的过程中起着重要的作用，它可以调控成纤维细胞分化为肌纤维母细胞，肌纤维母细胞促进胶原和细胞外基质的合成，导致心肌纤维化程度加重，心肌僵硬度增加，心室舒张功能障碍[8]。本研究发现青蒿素可以显著减轻心肌间质纤维化，同时也减少TGF-β1和collagen typeⅠ蛋白的表达，表明青蒿素通过下调TGF-β1蛋白表达，减少心肌纤维化，改善心脏功能。

总之，青蒿素可以抑制心肌梗死后心室重构，增强心功能。青蒿素的心脏保护作用可能是通过下调TGF-β1蛋白的表达，减少心肌纤维化实现的。

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