乳腺癌ER、PR和CerbB-2免疫组化对照芯片制作及其应用

朱忆凌，周新木，龚伟，黎庆荣，黄渊

（丽水市中心医院暨温州医学院附属第五医院 病理科，浙江 丽水 323000）

免疫组化技术已常规应用于病理诊断工作中，在病理诊断、术后治疗和预后评估等方面发挥了重要作用。乳腺癌术后雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR），以及原癌基因CerbB-2的测定，已广泛应用于临床。ER、PR阳性表达为术后内分泌治疗提供了理论依据；CerbB-2是乳腺癌预后不良的重要指标之一，其过度表达提示肿瘤细胞复发率高，对化疗和内分泌治疗不敏感[1]。目前，大多数医院采用国内通用标准来判定CerbB-2染色结果的阳性强度，但是在判读中存在主观上的不稳定性，尤其是CerbB-2++的判读可重复性不高[2]。ER、PR免疫组化染色结果目前尚无统一判断标准。另外，免疫组化技术本身影响质量的因素较多，设置适当的对照在乳腺癌免疫组化实验中是质量控制的关键。组织芯片具有体积小、信息含量高、快速、低消耗和可比性强等特点[3]，我们利用组织芯片制作的原理，改进芯片制作技术，在同一张切片上设立等级表达阳性对照和阴性对照，使得染色结果判读更为可靠，观察更加客观和方便，且方法简便可行，现介绍如下。

1 材料和方法

1.1 材料 从我院病理科档案免疫组化染色切片中筛选出乳腺癌ER、PR和CerbB-2具有清晰染色结果的病例，获得表达水平依次为-、+、++和+++的乳腺癌组织。自制采样器（内径1.8 mm的平头穿刺套管一套），APES涂胶片，免疫组化试剂一抗ER、PR和CerbB-2及EnVision TM Plus检测试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 染色结果的判断 CerbB-2免疫组化染色结果采用国内通用标准，阳性表达位于肿瘤细胞的胞膜，根据阳性细胞所占的百分数进行分组。评分标准：未见着色或<10%的肿瘤细胞膜着色，或仅有胞质非特异着色为-；>10%的肿瘤细胞阳性表达，显色弱且不连续为+；>10%的肿瘤细胞膜阳性表达，连续胞膜显色，强度中等为++；>10%的肿瘤细胞膜呈连续的强阳性表达为+++[1]。ER、PR以细胞核内有棕色颗粒为阳性，采用阳性百分比计数法：阳性表达<10%为-；阳性表达10%～30%为+；阳性表达30%～50%为++；阳性表达>50%为+++[4]。

1.3 组织芯片对照片的构建 复查HE及免疫组化染色切片，选择最具代表性的区域，画圈标记，再在组织蜡块上相应的区域进行标记。用自制采样器，从供体蜡块中采集组织芯，并按-、+、++和+++的次序依次放好。取出1 cm×1 cm包埋模具，先在模具底部滴入少许蜡液，放置加热台使其熔化，依次放入所取组织芯，紧密排成一行，然后将模具移置冷却台稍冷却，使组织芯位置稍固定后如同常规一般完成包埋。包埋盒书写号码侧与阴性对照一侧一致。将组织芯片蜡块进行连续切片，厚度4μm，裱贴APES涂胶载玻片的一端。60 ℃烤箱内烤片一夜后取出，储藏于干燥的切片盒内备用。

1.4 免疫组化染色 当常规病例需要做免疫组化染色时，从备用盒中取出1张对照芯片，将常规测试病例组织切片后，裱在对照芯片旁边，然后同时进行烤片、脱蜡、高压抗原热修复以及免疫组化EnVision染色，DAB显色，苏木精衬染，脱水、透明封固（见图1）。

图1 采样器、制成的蜡块与对照芯片

2 结果

手工制作对照芯片耗时短，方法简便，组织蜡芯排列整齐有序，无移位。在免疫组化染色时对对照芯片进行了测试，对照芯片无皱褶，抗原修复时无掉片。对照芯片与被测组织相邻，界限清楚，易于阅片，并且不影响被测组织的染色。对照芯片中乳腺癌组织ER、PR及CerbB-2-、+、++和+++免疫组化染色阳性信号清楚，强弱有差异，反映出乳腺癌组织中各抗原含量不同。显微镜下观察，对照芯片排列整齐，阅片者很容易相互参照查对阳性点位的染色状况（见图2-3），可以根据对照片内的组织染色状况判定受测组织是否进行了正确的染色过程，并且可以参照已知的阳性对照片染色给予受测组织较客观的判读。

3 讨论

乳腺癌为女性高发肿瘤，近几年发病率逐年上升，而病死率却逐年下降。这在很大程度上得益于对患者病情的准确判断及有针对性的治疗。检测乳腺癌ER、PR及CerbB-2表达情况，可指导内分泌治疗和靶向治疗，因此乳腺癌ER、PR、CerbB-2免疫组化检测的质量控制显得十分重要[5]。

图2 CerbB-2免疫组化结果模式图

图3 PR免疫组化结果模式图

在进行乳腺癌ER、PR、CerbB-2免疫组化染色时，为了确保染色片的质量和判读结果的准确性及可重复性，必须设立合理的对照，避免假阳性、假阴性结果以及主观判读的不稳定性。而通常的免疫组化对照法常采用外对照实验，抗体种类越多，准备的外对照切片种类就越多，因此组织耗费多且费时、费力；同时由于阳性对照组织与待测组织不在同一张载玻片上，实验条件无法达到完全一致[6]，如各步骤的时间、试剂的用量、抗原修复状况或其他人为因素等存在差异，均可能影响结果的准确性，使得免疫组化结果的判读缺乏可靠性。并且仅做强阳性对照片对照评估乳腺癌ER、PR和CerbB-2免疫组化染色结果是不准确的，对于强阳性病例，即使染色敏感性降低，仍可能呈阳性表达，因此乳腺癌免疫组化实验中制作单一抗体的不同阳性程度的对照片十分必要[7]。

我们运用组织芯片技术在乳腺癌ER、PR、CerbB-2免疫组化染色中设立等级对照具备以下优点：①组织芯片可根据不同需要进行组合和灵活设计，鉴于乳腺癌免疫组化染色结果判读的要求，我们选取以往ER、PR、CerbB-2免疫组化染色信号为-、+、++和+++表达清楚的乳腺癌组织为对照，制成对照芯片。阴性和不同等级的阳性组织均包含在内，比传统的单一阳性对照更可靠，更有效。②检测组织和对照芯片在同一张载玻片上，在相同条件下进行免疫组化染色，保证了实验条件的一致性，使结果更具可比性。③组织芯片对照片排列规整，与被测组织相邻，界线清楚，非常方便诊断医师阅片和查对。④组织芯面积很小，供体蜡块被破坏程度小，取出组织芯后，供体蜡块仍可存档保留。同时免疫组化染色切片归档保存时不需要另外单独保存阳性对照切片，更有利于档案管理。⑤组织芯蜡块制备后，可以一次性连续切取对照组织芯片数张，烤片后备用。为保证对照芯片的有效性，我们对不同保存时间的芯片进行免疫组化染色，结果证明对照芯片在室温条件下保存6个月内，其抗原性保存较好，不会出现抗原丢失，避免了重复切片造成的修片损失，且省时省力。⑥应用组织芯片技术制作使用的阳性对照组织比较小，节约了试剂的使用，降低了成本。⑦经过对组织芯片制作过程的改良，用自制采样器手工组织芯片制作过程十分简单，花费时间少。取样后，将组织芯按次序放入模具内按常规方法包埋，避免了用空白蜡块打孔后将组织芯埋入时出现的融合不够导致切片困难、组织缺失、飘散的现象。

总之，乳腺癌ER、PR、CerbB-2免疫组化染色设立等级对照十分必要，手工自制对照芯片方法简单，花费成本低，实用性强，值得临床推广应用。

[1] 董春鸽,章杰,吴亮,等. 乳腺癌伴神经内分泌分化与预后因素的相关性[J]. 温州医学院学报,2011,41(2):132-135.

[2] 王翠芝,周小鸽,黄受方,等.阳性对照组织芯片在乳腺癌CerbB-2免疫组化染色中的应用[J].诊断病理学杂志,2006,13(4):316-317.

[3] 祁旦已,王繁,周伶俐,等.组织芯片技术检测Galectin-3和CD44v6在子宫内膜癌中的表达及意义[J].温州医学院学报,2009,39(1):43-46.

[4] 郭欢续,白欧.乳腺癌ER、PR、Her-2表达与临床病理特征[J].中国实验诊断学杂志,2008,12(11):1390-1393.

[5] 吴秉铨,李玲.HER-2/neu基因和乳腺癌研究进展的启迪[J].中华病理学杂志,2002,31(3):197-198．

[6] 王翠芝,周小鸽,黄受方,等. 组织芯片在免疫组化染色阳性对照中的应用[J].临床与实验病理学杂志,2006,22(4):481-484.

[7] 郎志强,魏兵,唐源,等.免疫组化对照芯片的设计和应用[J].临床与实验病理学杂志,2005,21(2):235-236.