余维巍 黄骁燕 张 艳 夏 秦
华中科技大学同济医学院附属同济医院综合科,湖北 武汉 430030
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是具有呼吸道阻塞特征的慢性支气管炎,其形成过程包括肺泡巨噬细胞、T淋巴细胞和中性粒细胞增加,激活炎症细胞释放多种介质进一步刺激细胞外基质(ECM)沉积,导致呼吸道狭窄和呼吸道阻力增加。抑制炎性介质的释放和气管的纤维化对防治COPD及其并发症、改善患者的生活质量具有重要意义。近年来,黄芪多糖在多种急、慢性炎症中突出的免疫调节作用引起了人们的关注,本实验拟采用观察黄芪多糖对COPD大鼠肺组织中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、金属基质蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)表达的影响,来进一步探讨黄芪多糖对COPD的作用机制。
黄芪多糖 (四川百利药业有限责任公司,批号:080606);脂多糖(LPS)(Sigma 公司);香烟(云南红河卷烟厂软乙香烟,尼古丁含量:1.3 mg;焦油含量:14 mg);强的松片(西安利君沙制药股份有限公司);羟脯氨酸(MPO)试剂盒(南京建成生物工程研究所);MMP-9、TIMP-1抗体(武汉博士德公司)。
健康Wistar雄性大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物学部提供)40只,平均体重250~300 g,适应性饲养环境1周后采用随机数字法将动物分为4组:正常对照组、COPD组、黄芪多糖组、强的松组,每组10只。①正常对照组:未作任何干预,每日用1 mL生理盐水灌胃作为对照;②COPD组:第 1、16 天,气管内注入 1 g/L 的 LPS 200 μL/次,第 2~15天和第17~30天将大鼠放入有机玻璃熏箱内被动吸烟,每天熏烟2次,每次20支香烟,时间持续1 h,2次熏烟间隔4 h,每天熏烟前0.5 h以1 mL生理盐水灌胃作为对照;③黄芪多糖组:模型制备方法同COPD组,但每天熏烟前0.5 h以蒸馏水溶解黄芪多糖颗粒灌胃(40 mg/kg);④强的松组:模型制备方法同COPD组,将强的松片研成粉末,加蒸馏水溶解,熏烟前0.5 h按6 mg/kg灌胃。
1.3.1 取材方法 到第31天时,大鼠经股动脉放血处死,打开胸腔结扎右主支气管,取右下叶部分肺组织待检测羟脯氨酸含量,余右肺组织以10%的中性福尔马林固定,24 h以后石蜡包埋、切片,常规HE染色镜检。左肺用10%的中性福尔马林固定20 min,常规脱水,透明,浸蜡包埋,待免疫组化检测。
1.3.2 肺组织中羟脯氨酸含量测定 取大鼠肺组织用匀浆器在冰浴下制成10%匀浆,3000 r/min离心10 min,取上清,按照羟脯氨酸试剂盒说明书进行操作,考马斯亮蓝法测定肺组织羟脯氨酸蛋白含量。
1.3.3 肺功能检测 处死动物前采用AniRes动物肺功能仪进行大鼠肺功能测定。以3%戊巴比妥钠70 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠,气管插管,将大鼠放进体扫描仪内,连接动物肺功能仪,描记一段平静呼吸后,在呼气末以相当于潮气量4倍的气量充气(相当于深呼气),所引起的容积变化经微机处理算出0.2 s用力呼吸量 (FEV0.2)、FEV0.2与用力肺活量比值(FEV0.2/FVC)以及吸气阻力(Ri)、呼气阻力(Re)。
1.3.4 肺组织MMP-9和TIMP-1蛋白含量测定 取左肺石蜡切片(6 μm)作免疫组织化学染色(SP法)。免疫组化染色以细胞胞浆中出现黄色或棕黄色颗粒为阳性反应,每组染色切片随机选取10个视野,经图像扫描测定每组免疫反应阳性信号强度的平均吸光度(A),求出平均值,然后用统计学方法进行半定量分析。
应用SPSS 13.0软件包进行统计学处理,计量资料数据以均数±标准差()表示,多组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验,对相关指标进行Spearman法直线相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
光镜下观察,正常对照组肺组织结构基本正常,COPD组大鼠肺泡壁增厚,间质内大量炎症细胞浸润,肺泡间隔明显增宽,局部可见代偿性肺气肿,证实造模成功,黄芪多糖组及强的松组肺泡壁增厚较COPD组有所减轻,炎性细胞浸润减少。
与正常对照组比较,COPD组FEV0.2、FEV0.2/FVC均显著减少,Re、Ri显著增大(均 P < 0.05);与 COPD 组比较,黄芪多糖组和强的松组FEV0.2、FEV0.2/FVC均增多,Re、Ri减少(均P<0.05),其中强的松组改善最为显著。见表1。
表1 各组大鼠肺功能水平()
表1 各组大鼠肺功能水平()
注:1 cm H2O=0.098 kPa;与正常对照组比较,*P<0.05;与COPD组比较,△P<0.05
组别 FEV0.2(mL) FEV0.2/FVC Re(cm H2O) Ri(cm H2O)正常对照组COPD组黄芪多糖组强的松组7.25±1.285.15±0.74*6.22±1.02△6.98±1.21△90.11±5.9958.70±4.21*70.21±6.27△79.62±3.65△1.10±0.363.56±0.48*2.41±0.32△1.99±0.54△2.78±0.354.15±0.55*3.25±0.26△3.78±0.42△
COPD组大鼠肺组织羟脯氨酸含量较正常对照组明显增加(P<0.01);黄芪多糖和强的松干预后,羟脯氨酸含量明显减少(P<0.05或P<0.01)。见表2。
COPD 组大鼠肺组织 MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1水平较正常对照组明显增加(P<0.05或P<0.01);黄芪多糖和强的松干预后,MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1 水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。见表2。
表2 大鼠肺组织羟脯氨酸、基质金属蛋白酶-9、金属基质蛋白酶抑制剂-1含量变化()
表2 大鼠肺组织羟脯氨酸、基质金属蛋白酶-9、金属基质蛋白酶抑制剂-1含量变化()
注:与正常对照组比较,#P<0.01,*P<0.05;与COPD组比较,##P<0.01,△P < 0.05
组别 羟脯氨酸(mg/g) MMP-9蛋白 TIMP-1蛋白 MMP-9/TIMP-1正常对照组COPD组黄芪多糖干预组强的松干预组2.35±0.287.25±0.74#5.98±0.29△4.97±0.32##25.11±3.2170.23±6.27*58.59±5.31△46.52±2.89△28.71±7.2139.60±3.65*31.31±5.02△30.22±4.39△0.91±0.201.98±0.45*1.56±0.37△1.32±0.24△
正常对照组、COPD组、黄芪组、强的松组肺组织MMP-9/TIMP-1水平与FEV0.2/FVC呈负相关(相关系数r=-0.411、-0.621、-0.684、-0.542,均 P < 0.05)。
COPD是一种以进行性的气流阻塞和持续性的炎症过程为特征的疾病,目前认为其病变早期是以炎症细胞浸润为主,后期表现为ECM沉积在气道壁导致细支气管壁的增厚和呼吸道重建[1-2]。ECM的降解和沉积失衡是导致气道壁结构异常构建、肺实质破坏和间质增生的重要原因。基质金属蛋白酶(MMPs)是一组具有相同功能、结构高度同源、依赖锌离子的内肽酶的总称,MMP-9是MMPs家族的重要成员,能降解气道和肺泡的ECM和基底膜,参与其重构和炎细胞趋化,在COPD的发病中占重要地位[3],TIMPs是MMPs的内源性天然抑制因子,能与MMPs形成1∶1复合体抑制其活性,它有五种亚型,其中TIMP-1是活性最强的一种,能特异性抑制MMP-9的活性,TIMP-1还具有细胞生长因子样作用,能使ECM沉积并抑制其降解,是气道纤维化的标志,反映了呼吸道修复重塑的过程[4]。MMP-9/TIMP-1的平衡是维持ECM正常状态所必须的,一旦平衡打破则出现病理状态,MMP-9/TIMP-1比值升高,表明呼吸道以炎症反应为主,将引起组织破坏,MMP-9/TIMP-1比值下降,表面呼吸道以修复为主,过度降低(尤其是TIMP-1过度升高时)将出现纤维化可能[5]。本试验中,COPD组MMP-9及TIMP-1均较正常组明显升高,MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1 水平的升高与COPD 肺功能的下降、羟脯氨酸水平的升高有相关性,羟脯氨酸是反应组织纤维化程度的重要指标,上述结果提示MMP-9、TIMP-1在肺组织的损伤及纤维化方面起着重要作用。
COPD属于中医咳嗽、痰饮、喘症的范畴,其病因与外邪入侵和内伤有关,中医理论认为肺主气,朝百脉,乃是气、血、津液汇聚之地,气虚、血淤是COPD形成的重要病理基础[6],而中药黄芪多糖是传统补气中药,可补气血,去淤散结,有助于气血畅行,目前黄芪多糖在调节免疫方面的作用倍受关注,既往有试验提示黄芪多糖可以抗纤维化[7],故本试验将黄芪多糖作为干预药物,观察其对肺组织病理、MPO、MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1表达的影响,并将其与强的松作对比来观测其疗效。试验结果显示:黄芪多糖能使肺泡壁间隔增厚减轻,炎性细胞浸润减少,并能部分改善局灶性肺气肿,肺功能改善,使MPO、MMP-9、TIMP-1表达减少,MMP-9/TIMP-1比值减低,其作用与强的松有类似之处。据此笔者推论:黄芪可能通过降低肺组织羟脯氨酸的水平,抑制肺组织中MMP-9、TIMP-1的含量,降低MMP-9/TIMP-1比值来使ECM的合成和降解趋于平衡,这一作用有助于改善呼吸道的无效重构和肺纤维化程度,因此肺功能得以改善。同时显示,黄芪多糖及强的松对肺功能的改善和MMP-9/TIMP-1的降低呈正相关,与之前MMP-9/TIMP-1比值减低时肺损伤倾向于修复的观点一致,但本试验结果显示,使用黄芪多糖和强的松后,MPO降低,与之前的MMP-9/TIMP-1比值降低肺部病变倾向于修复、有纤维化可能似乎有矛盾,但表2显示,使用黄芪多糖后,MMP-9的减低幅度显著高于TIMP-1,导致MMP-9/TIMP-1降低的主因是MMP-9的减低,提示黄芪多糖可能通过改善MMP-9/TIMP-1的比例来改善肺纤维化。对于黄芪多糖是通过何种途径来影响MMP-9及TIMP-1的表达目前知之甚少,黄芪多糖对肺炎性因子表达的影响亦不清楚,这对进一步理解其作用机制有着重要意义,可作为下一步的研究目标。
目前对抑制MMP-9的表达及减轻肺损伤的药物的研究正成为药理学的研究热点,一系列合成抑制物在动物试验中已发挥明显作用,但也因副作用而受到制约。中药黄芪多糖毒副作用小,整体改善患者病情,本试验进一步证实了其在COPD中的疗效,提示黄芪多糖可能通过影响MMP-9/TIMP-1的比值来促进肺组织的修复。
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