黄芪多糖对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织内基质金属蛋白酶-9、金属基质蛋白酶抑制剂-1表达的影响

余维巍 黄骁燕 张 艳 夏 秦

华中科技大学同济医学院附属同济医院综合科，湖北 武汉 430030

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是具有呼吸道阻塞特征的慢性支气管炎，其形成过程包括肺泡巨噬细胞、T淋巴细胞和中性粒细胞增加，激活炎症细胞释放多种介质进一步刺激细胞外基质（ECM）沉积，导致呼吸道狭窄和呼吸道阻力增加。抑制炎性介质的释放和气管的纤维化对防治COPD及其并发症、改善患者的生活质量具有重要意义。近年来，黄芪多糖在多种急、慢性炎症中突出的免疫调节作用引起了人们的关注，本实验拟采用观察黄芪多糖对COPD大鼠肺组织中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、金属基质蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）表达的影响，来进一步探讨黄芪多糖对COPD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

黄芪多糖 （四川百利药业有限责任公司，批号：080606）；脂多糖（LPS）（Sigma 公司）；香烟（云南红河卷烟厂软乙香烟，尼古丁含量：1.3 mg；焦油含量：14 mg）；强的松片（西安利君沙制药股份有限公司）；羟脯氨酸（MPO）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；MMP-9、TIMP-1抗体（武汉博士德公司）。

1.2 模型的建立、分组与标本处理

健康Wistar雄性大鼠（华中科技大学同济医学院实验动物学部提供）40只，平均体重250～300 g，适应性饲养环境1周后采用随机数字法将动物分为4组：正常对照组、COPD组、黄芪多糖组、强的松组，每组10只。①正常对照组：未作任何干预，每日用1 mL生理盐水灌胃作为对照；②COPD组：第 1、16 天，气管内注入 1 g/L 的 LPS 200 μL/次，第 2～15天和第17～30天将大鼠放入有机玻璃熏箱内被动吸烟，每天熏烟2次，每次20支香烟，时间持续1 h，2次熏烟间隔4 h，每天熏烟前0.5 h以1 mL生理盐水灌胃作为对照；③黄芪多糖组：模型制备方法同COPD组，但每天熏烟前0.5 h以蒸馏水溶解黄芪多糖颗粒灌胃（40 mg/kg）；④强的松组：模型制备方法同COPD组，将强的松片研成粉末，加蒸馏水溶解，熏烟前0.5 h按6 mg/kg灌胃。

1.3 观测指标及方法

1.3.1 取材方法 到第31天时，大鼠经股动脉放血处死，打开胸腔结扎右主支气管，取右下叶部分肺组织待检测羟脯氨酸含量，余右肺组织以10%的中性福尔马林固定，24 h以后石蜡包埋、切片，常规HE染色镜检。左肺用10%的中性福尔马林固定20 min，常规脱水，透明，浸蜡包埋，待免疫组化检测。

1.3.2 肺组织中羟脯氨酸含量测定 取大鼠肺组织用匀浆器在冰浴下制成10%匀浆，3000 r/min离心10 min，取上清，按照羟脯氨酸试剂盒说明书进行操作，考马斯亮蓝法测定肺组织羟脯氨酸蛋白含量。

1.3.3 肺功能检测 处死动物前采用AniRes动物肺功能仪进行大鼠肺功能测定。以3%戊巴比妥钠70 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，气管插管，将大鼠放进体扫描仪内，连接动物肺功能仪，描记一段平静呼吸后，在呼气末以相当于潮气量4倍的气量充气（相当于深呼气），所引起的容积变化经微机处理算出0.2 s用力呼吸量 （FEV0.2）、FEV0.2与用力肺活量比值（FEV0.2/FVC）以及吸气阻力（Ri）、呼气阻力（Re）。

1.3.4 肺组织MMP-9和TIMP-1蛋白含量测定 取左肺石蜡切片（6 μm）作免疫组织化学染色（SP法）。免疫组化染色以细胞胞浆中出现黄色或棕黄色颗粒为阳性反应，每组染色切片随机选取10个视野，经图像扫描测定每组免疫反应阳性信号强度的平均吸光度（A），求出平均值，然后用统计学方法进行半定量分析。

1.4 统计学方法

应用SPSS 13.0软件包进行统计学处理，计量资料数据以均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，对相关指标进行Spearman法直线相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肺组织病理改变

光镜下观察，正常对照组肺组织结构基本正常，COPD组大鼠肺泡壁增厚，间质内大量炎症细胞浸润，肺泡间隔明显增宽，局部可见代偿性肺气肿，证实造模成功，黄芪多糖组及强的松组肺泡壁增厚较COPD组有所减轻，炎性细胞浸润减少。

2.2 大鼠肺功能水平

与正常对照组比较，COPD组FEV0.2、FEV0.2/FVC均显著减少，Re、Ri显著增大（均 P ＜ 0.05）；与 COPD 组比较，黄芪多糖组和强的松组FEV0.2、FEV0.2/FVC均增多，Re、Ri减少（均P＜0.05），其中强的松组改善最为显著。见表1。

表1 各组大鼠肺功能水平（）

表1 各组大鼠肺功能水平（）

注：1 cm H2O=0.098 kPa；与正常对照组比较，*P＜0.05；与COPD组比较，△P＜0.05

组别 FEV0.2（mL） FEV0.2/FVC Re（cm H2O） Ri（cm H2O）正常对照组COPD组黄芪多糖组强的松组7.25±1.285.15±0.74*6.22±1.02△6.98±1.21△90.11±5.9958.70±4.21*70.21±6.27△79.62±3.65△1.10±0.363.56±0.48*2.41±0.32△1.99±0.54△2.78±0.354.15±0.55*3.25±0.26△3.78±0.42△

2.3 大鼠肺组织羟脯氨酸含量

COPD组大鼠肺组织羟脯氨酸含量较正常对照组明显增加（P＜0.01）；黄芪多糖和强的松干预后，羟脯氨酸含量明显减少（P＜0.05或P＜0.01）。见表2。

2.4 大鼠肺组织中 MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1 蛋白水平

COPD 组大鼠肺组织 MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1水平较正常对照组明显增加（P＜0.05或P＜0.01）；黄芪多糖和强的松干预后，MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1 水平明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。见表2。

表2 大鼠肺组织羟脯氨酸、基质金属蛋白酶-9、金属基质蛋白酶抑制剂-1含量变化（）

表2 大鼠肺组织羟脯氨酸、基质金属蛋白酶-9、金属基质蛋白酶抑制剂-1含量变化（）

注：与正常对照组比较，#P＜0.01，*P＜0.05；与COPD组比较，##P＜0.01，△P ＜ 0.05

组别 羟脯氨酸（mg/g） MMP-9蛋白 TIMP-1蛋白 MMP-9/TIMP-1正常对照组COPD组黄芪多糖干预组强的松干预组2.35±0.287.25±0.74#5.98±0.29△4.97±0.32##25.11±3.2170.23±6.27*58.59±5.31△46.52±2.89△28.71±7.2139.60±3.65*31.31±5.02△30.22±4.39△0.91±0.201.98±0.45*1.56±0.37△1.32±0.24△

2.5 相关性分析

正常对照组、COPD组、黄芪组、强的松组肺组织MMP-9/TIMP-1水平与FEV0.2/FVC呈负相关（相关系数r=-0.411、-0.621、-0.684、-0.542，均 P ＜ 0.05）。

3 讨论

COPD是一种以进行性的气流阻塞和持续性的炎症过程为特征的疾病，目前认为其病变早期是以炎症细胞浸润为主，后期表现为ECM沉积在气道壁导致细支气管壁的增厚和呼吸道重建[1-2]。ECM的降解和沉积失衡是导致气道壁结构异常构建、肺实质破坏和间质增生的重要原因。基质金属蛋白酶（MMPs）是一组具有相同功能、结构高度同源、依赖锌离子的内肽酶的总称，MMP-9是MMPs家族的重要成员，能降解气道和肺泡的ECM和基底膜，参与其重构和炎细胞趋化，在COPD的发病中占重要地位[3]，TIMPs是MMPs的内源性天然抑制因子，能与MMPs形成1∶1复合体抑制其活性，它有五种亚型，其中TIMP-1是活性最强的一种，能特异性抑制MMP-9的活性，TIMP-1还具有细胞生长因子样作用，能使ECM沉积并抑制其降解，是气道纤维化的标志，反映了呼吸道修复重塑的过程[4]。MMP-9/TIMP-1的平衡是维持ECM正常状态所必须的，一旦平衡打破则出现病理状态，MMP-9/TIMP-1比值升高，表明呼吸道以炎症反应为主，将引起组织破坏，MMP-9/TIMP-1比值下降，表面呼吸道以修复为主，过度降低（尤其是TIMP-1过度升高时）将出现纤维化可能[5]。本试验中，COPD组MMP-9及TIMP-1均较正常组明显升高，MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1 水平的升高与COPD 肺功能的下降、羟脯氨酸水平的升高有相关性，羟脯氨酸是反应组织纤维化程度的重要指标，上述结果提示MMP-9、TIMP-1在肺组织的损伤及纤维化方面起着重要作用。

COPD属于中医咳嗽、痰饮、喘症的范畴，其病因与外邪入侵和内伤有关，中医理论认为肺主气，朝百脉，乃是气、血、津液汇聚之地，气虚、血淤是COPD形成的重要病理基础[6]，而中药黄芪多糖是传统补气中药，可补气血，去淤散结，有助于气血畅行，目前黄芪多糖在调节免疫方面的作用倍受关注，既往有试验提示黄芪多糖可以抗纤维化[7]，故本试验将黄芪多糖作为干预药物，观察其对肺组织病理、MPO、MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1表达的影响，并将其与强的松作对比来观测其疗效。试验结果显示：黄芪多糖能使肺泡壁间隔增厚减轻，炎性细胞浸润减少，并能部分改善局灶性肺气肿，肺功能改善，使MPO、MMP-9、TIMP-1表达减少，MMP-9/TIMP-1比值减低，其作用与强的松有类似之处。据此笔者推论：黄芪可能通过降低肺组织羟脯氨酸的水平，抑制肺组织中MMP-9、TIMP-1的含量，降低MMP-9/TIMP-1比值来使ECM的合成和降解趋于平衡，这一作用有助于改善呼吸道的无效重构和肺纤维化程度，因此肺功能得以改善。同时显示，黄芪多糖及强的松对肺功能的改善和MMP-9/TIMP-1的降低呈正相关，与之前MMP-9/TIMP-1比值减低时肺损伤倾向于修复的观点一致，但本试验结果显示，使用黄芪多糖和强的松后，MPO降低，与之前的MMP-9/TIMP-1比值降低肺部病变倾向于修复、有纤维化可能似乎有矛盾，但表2显示，使用黄芪多糖后，MMP-9的减低幅度显著高于TIMP-1，导致MMP-9/TIMP-1降低的主因是MMP-9的减低，提示黄芪多糖可能通过改善MMP-9/TIMP-1的比例来改善肺纤维化。对于黄芪多糖是通过何种途径来影响MMP-9及TIMP-1的表达目前知之甚少，黄芪多糖对肺炎性因子表达的影响亦不清楚，这对进一步理解其作用机制有着重要意义，可作为下一步的研究目标。

目前对抑制MMP-9的表达及减轻肺损伤的药物的研究正成为药理学的研究热点，一系列合成抑制物在动物试验中已发挥明显作用，但也因副作用而受到制约。中药黄芪多糖毒副作用小，整体改善患者病情，本试验进一步证实了其在COPD中的疗效，提示黄芪多糖可能通过影响MMP-9/TIMP-1的比值来促进肺组织的修复。

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[6]张文江，张燕萍.中医药防治慢性阻塞性肺疾病研究近况[J].北京中医药大学学报：中医临床版，2007，14（5）：5.

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