高效液相色谱法同时测定苯妥英钠和卡马西平的血药浓度

苏煌财，林玉仙，张宏

福州市第一医院临床药学科 福建 福州 350009

苯妥英钠(phenytoin sodium，DPH)、卡马西平(carbamazepine，CBZ)是临床常用的一线抗癫痫药物。苯妥英钠临床常用于癫痫大发作治疗，卡马西平是癫痫单纯和复杂部分性发作的首选药物。苯妥英钠、卡马西平在药物动力学方面存在较大个体差异，卡马西平治疗窗口狭窄，治疗量与中毒量很接近，因此临床上需要进行监测用药[1,2]。苯妥英钠和卡马西平临床经常有联合用药情况，建立高效液相色谱法同时测定人血清中苯妥英钠(DPH) 、卡马西平(CBZ)的药物浓度是很有必要的，已有文献报道[3,4]。本研究采用简便、快速、灵敏、重现性好的高效液相色谱法来同时测定苯妥英钠和卡马西平的血药浓度。

1 试药与仪器

1.1 试药 标准品：苯妥英钠(批号200401，中国药品生物制品检定所)、卡马西平(批号9503，中国药品生物制品检定所)；内标：苯乙酮(德国进口)。流动相：甲醇(国药集团化学试剂有限公司) 为色谱纯；盐酸(分析纯)；二重蒸馏水。

1.2 仪器 Waters高效液相色谱仪，包括515型溶剂泵，7725i手动进样器，Waters 2487双波长紫外检测器，Empower软件。TG-328电光分析天平(上海精密科学仪器有限公司)；1612-3型台式高速离心机(上海医疗器械有限公司手术器械厂)；XW-80A漩涡混合器(上海医大仪器厂)；PHS-3C型精密酸度计(上海大普仪器有限公司)。

2 测定前处理

2.1 色谱条件 以Symmetryshield RP18(5.0μm ,3.9×150mm)色谱柱，甲醇:水(50:50)为流动相；使用前经0.45μm微孔滤膜过滤。流速：1.0mL·min-1,柱温：25℃，进样量：20μL，检测波长：210nm，灵敏度：0.5AUFS。

2.2 标准品配置 精密称取苯妥英钠1.2mg、卡马西平1.0mg，分别置于25mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得苯妥英钠(浓度为44mg·L-1)、卡马西平(浓度为40mg·L-1)储备液，将以上两种储备液定量稀释成一系列苯妥英钠、卡马西平标准储备液。苯乙酮4℃密度为1.028，取5mL定容至25mL，再取100μL定容至50mL即得到41.12mg·L-1。

2.3 样品处理 精密量取血浆0.1mL，精密加入内标20μL及0.1M盐酸15μL，精密加入甲醇200μL，漩涡混匀3min，10000r·min-1[1]离心4min，取上清液20μL，进样分析。

2.4 方法专属性 按上述色谱条件和血浆处理方法检测，色谱图如图1。各种药物保留时间分别为tR内=3.818min、tRcbz=5.170min、tRpt=5.986min，峰形较好，血浆中杂质不干扰测定。

3 方法与结果

3.1 标准曲线的绘制 精密量取苯妥英钠、卡马西平标准品储备液，分别加入空白血浆相应毫升数，配成一系列浓度苯妥英钠(2.2，4.4，8.8，11.0，17.6，22.0，33.0 mg·L-1)、卡马西平(2.0，4.0，8.0，10.0，20.0，30.0 mg·L-1)溶液。按本实验相应的方法项进行处理，并进行HPLC检测，采用内标法进行线性回归，测得回归方程：卡马西平Y=1.60e+005X-6.14e+004(r=0.9998)；苯妥英钠Y=9.40e+004X-1.28e+005(r=0.9994)。

3.2 提取回收率的测定 精密量取苯妥英钠、卡马西平标准品储备液，加入甲醇配制成高、中、低3个不同浓度即苯妥英钠33.0、17.6、2.2mg·L-1，卡马西平30.0、10.0、2.0mg·L-1。取20μL进样，记录峰面积为A1；另取空白血浆0.1mL，加入高、中、低相应浓度的苯妥英钠、卡马西平标准品储备液，按2.3项下操作，记录样品的峰面积A2，以A2/A1之值计算提取回收率。见表1。

表1 提取回收率试验结果(n=5)Tab1 Results of recovery test(n=5)

表2 苯妥英钠和卡马西平的日内和日间精密度(n=3)Tab2 Within day and between day precision of Phenytoin,Carbamazepine (n=3)

结果表明，高、中、低3个浓度的2种标准品的提取回收率均大于90%，RSD＜2%，满足生物样品测定的要求。

3.3 精密度考察 精密量取苯妥英钠、卡马西平标准品储备液，加入空白血浆配制成高、中、低3种不同浓度的样品液各6份，在不同天内连续制备并测定3个分析批，计算苯妥英钠和卡马西平的日内和日间精密度。见表2。各值均小于2%，满足生物样品测定的要求。

3.4 干扰性试验 根据我院的特点，在上述色谱条件下，进行地西泮、氯硝西泮、扑米酮、氨茶碱、环孢素A等多种药物的测试，均不干扰苯妥英钠、卡马西平、苯乙酮的测定。

4 讨论

本实验建立的HPLC法在灵敏度、重现性、专一性、线性范围、回收率等多方面都有明显的优势。在测定波长的选择上，经紫外扫描后苯妥英、卡马西平在210nm 处吸收最强且线性关系较好，故选择210nm 为测定波长，这与相应的文献报道相吻合；本实验的样品预处理简单，采用沉淀法操作简单、重现性好，且仪器的灵敏度能够达到测定要求。考虑到用甲醇沉淀血浆的上层清液pH为8.5～9.5[5]，人体血清含Cl-的浓度为96～108mmol·L-1[6]，所以可以用0.1mol·L-1盐酸15μL，将沉淀液pH降至7.2左右，起到保护色谱柱的作用；流动相采用甲醇与水体积比50:50，这一组无干扰内标、苯妥英、卡马西平主峰，且分离都达到相应要求。无须在流动相中加入有毒或腐蚀性的成分，可延长色谱柱的寿命。

[1]陈 刚.治疗药物监测[M].北京:人民军医出版社,1988:385.

[2]沈鼎烈.癫痫治疗的现状[J].中国神经精神疾病杂志,2001,27(1):1.

[3]冯惠平,吴佳滨,李碧峰等.反相高效液相色谱法同时测定苯妥英钠、卡马西平的血药浓度[J].中国药业,2008,17(7):54-55.

[4]李朋梅,张相林,唐崑等.高效液相色谱法同时测定苯巴比妥、卡马西平及苯妥英钠的血药浓度[J].中日友好医院学报,2007,21(5):312-315.

[5]刘文英.药物分析[M].第五版,北京:人民卫生出版社,2000:88.

[6]张建国.诊断学[M].第四版.北京:人民卫生出版社,1990:463.