微透析探针回收率探讨及提高脂溶性药物回收率的方法

蔡俊飞，范 晓，李亶烨，张 昆，马云淑*

(1.云南中医药大学中药学院，昆明 650500；2.云南省高校外用给药系统与制剂技术研究重点实验室，昆明 650500)

微透析技术是一种用于分析体内细胞外液中生化物质的采样技术[1]，具有连续取样、动态观察、定量分析、采样量小和组织损伤轻等特点[2]。1972 年 Delgado J M等[3-5]发明了微透析探针，人们将其应用在脑微透析的神经科学领域。随着微透析技术的发展和各种检测技术的不断更新，微透析技术的应用范围进一步扩大。目前，微透析技术被广泛用于药物在体内、靶器官和靶组织中的药动学研究[6]。

1 影响微透析探针回收率的因素

微透析技术取样时，药物顺浓度梯度沿着探针的半透膜进入灌流液中，然后被连续灌流的灌流液带出，最终进入收集器中。由于微透析取样的连续性，灌流液流经半透膜有效部位的时间很短，所以体系处于非平衡状态，药物在半透膜两侧的交换并不完全，收集到的透析液中化合物浓度只是探针周围样品实际浓度的一部分，并非靶器官或组织内该成分的真实含量，因此需要通过回收率的校正。

微透析回收率是指从灌流液中流出的待测组分与对照品溶液的浓度之比。影响探针回收率的因素很多，主要包括半透膜长度、灌流液流速、灌流液成分、搅拌速度、药物质量浓度、探针使用次数、探针植入时间、灌流液的pH值、温度和探针类型等。

1.1半透膜长度 微透析探针膜越长，膜表面积就越大。根据 Ficks 扩散定律，膜表面积越大扩散速度越快，回收率越高[7]。吴黎莉等[8]研究微透析探针膜长度对醋酸曲安奈德回收率的影响，结果发现，相同条件下CMA30探针(膜长10 mm)比CMA20(膜长 4 mm)回收率高。徐宇琦等[9]研究微透析探针膜长对京尼平苷回收率的影响。结果显示，膜长为10、15 mm时，探针的回收率分别为34.32%±1.35%、42.97%±0.93%，表明微透析探针的回收率随探针膜长的增加而增大。

微透析探针体内回收率通常较低，加上检测仪器灵敏度的限制，为了提高实验结果的准确性，在实验过程中通常需要选择膜长较长的微透析探针提高探针的回收率。探针膜长的选择需要根据取样部位确定，较均一的组织(如皮肤、血液等)应选用膜较长的探针，这样可以提高探针的回收率。但在脑、关节等精细部位，采用膜太长的探针不方便定位，且容易损坏探针，所以需要选用膜较短的探针。

1.2灌流液流速 微透析取样时，灌流液的流速通常为0.5～3 μL·min-1。通常灌流液流速越慢，探针回收率越高；流速越快，回收率越低。陈腾飞等[10]把微透析探针植入大鼠脑、颈静脉，分别以 0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 μL·min-1的流速灌流栀子苷溶液。结果发现，灌流速度为0.5～3.0 μL·min-1时，随着灌流速度的增加，微透析探针对栀子苷的回收率逐渐降低。

实验中应根据具体情况，如透析液中药物浓度、检测仪器的灵敏度和检测方法等选择合适的灌流速度。如果透析液中药物浓度较高，在保证药物能被检测到的前提下可适当增加灌流速度；如果透析液中药物浓度较低，在保证收集到的样品量能够用于检测的前提下可适当降低灌流速度。

1.3灌流液成分 在选择微透析灌流液时，为了减少灌流液对待测组织和待测物的影响，灌流液通常选用接近细胞外液的林格氏液或磷酸盐缓冲液(PBS)。但灌流液中含有 K+、Ca2+和 Mg2+等，这些离子可显著影响多种神经递质的释放及其代谢物的浓度，从而影响探针的回收率[7]。詹淑玉等[11]采用等渗氯化钠溶液、林格氏液、PBS和葡萄糖溶液作为灌流液，研究不同灌流液对葛根素回收率的影响。结果发现，以上述4种溶液为灌流液时探针的回收率分别为71.25%±2.36%、73.48%±1.41%、68.50%±2.43%、74.98%±1.16%，说明灌流液成分会影响探针对葛根素的回收率。吴丽颖等[12]采用含体积分数为0.1%甲酸和不含甲酸的葡萄糖溶液作为灌流液测定氯己定的体外回收率。结果发现，含体积分数为0.1%甲酸的葡萄糖溶液和不含甲酸的葡萄糖溶液作为灌流液时，回收率分别为29.9%、18.7%。说明在灌流液中添加体积分数为0.1%的甲酸能明显提高探针的回收率。

1.4搅拌速度 微透析体外实验中，为了得到稳定的探针回收率，往往把探针置于充分搅拌的介质中，消除对流引起的浓度边界效应从而影响药物的传质阻力，使微透析探针回收率稳定[13]。詹淑玉等[11]以林格氏液为灌流液，采用0、100、150、200、250、300 r·min-1的转速搅拌灌流液，测定葛根素体外回收率，结果发现，探针体外回收率随着搅拌速度的增大而增大，当搅拌速度达到200 r·mim-1时，探针的回收率稳定在70%左右。

1.5药物质量浓度 在微透析体内实验中，取样时间较长，药物质量浓度处于随时变化的状态，为确保微透析所得的药物质量浓度能准确反映待测部位的实际药物质量浓度，需要测定不同药物质量浓度下探针的回收率，考察药物质量浓度是否会影响探针的回收率。许小建等[14]研究不同质量浓度的左氧氟沙星对微透析探针回收率的影响，结果发现，不同质量浓度(1、8、40 μg·mL-1)的左氧氟沙星在微透析探针中的回收率分别为58.81%±2.20%、58.74%±1.59%、60.10%±3.51%，说明药物质量浓度对微透析探针回收率几乎无影响。徐宇琦等[9]采用林格氏液为灌流液，研究不同质量浓度的京尼平苷(2.5、5.0、10.0 μg·mL-1)对微透析探针回收率的影响，结果发现，探针回收率与京尼平苷质量浓度无关。

1.6探针使用次数 微透析探针较贵，为减少实验成本，新探针使用后通常不会丢弃，而是清洗后保存在纯水中下次继续使用。因此需要测定探针使用后的回收率，考察探针使用后回收率是否会发生改变。陈腾飞等[15]以人参皂苷Rg1为检测药物，采用正透析法分别测定新探针、使用过1次和使用过2次的脑、血微透析探针回收率，结果显示，使用过1次和使用过2次并经过处理的探针与新探针相比，回收率无明显变化。说明在探针使用后，用20 g·L-1的肝素钠溶液、超纯水灌流冲洗处理，能够维持探针半透膜的通透性。陈腾飞等[16]采用增量法对新探针、使用过1次和使用过2次并经过恢复处理的探针进行体外回收率实验，结果显示，使用过1次和2次并经过恢复处理后的脑、血探针对黄芩苷的回收率与新探针相比，无明显变化。

1.7探针植入时间 微透析实验中，取样时间通常较长，因此，需要考察探针植入动物体内一段时间后回收率的稳定性。郭丽蓉等[17]把微透析探针植入大鼠皮下，连续取样10 h，测定乌头碱在探针中的回收率，结果发现，乌头碱在大鼠体内的回收率10 h内基本保持稳定，说明探针植入时间不影响探针的回收率。刘杨等[18]把微透析探针植入大鼠海马与脑，连续取样9 h，采用高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法测定人参皂苷Rg1在探针中的回收率，结果表明，人参皂苷Rg1在大鼠体内的回收率9 h内保持稳定。

1.8灌流液的pH值 微透析灌流液的pH值对探针回收率的影响主要表现在2个方面：首先是导致探针膜结构的改变，从而影响药物顺浓度梯度的跨膜运动；其次是影响药物在灌流液中的溶解度和稳定性。唐红艳等[19]以不同pH值的PBS为灌流液，采用增量法测定雪上一枝蒿甲素在微透析探针中的回收率，结果发现，以pH值为 6.5、7.4、8.5的PBS为灌流液时，雪上一枝蒿甲素的回收率分别为34.4%±8.31%、71.8%±1.71%、67.1%±1.24%，表明灌流液的pH值对雪上一枝蒿甲素在微透析探针中的回收率影响较大。

1.9温度 温度升高，分子热运动加快，药物扩散速度加快，微透析探针回收率增大。孟英姣等[20]采用林格氏液和人工脑脊液为灌流液，研究不同温度(25、30、37、42 ℃)对芒柄花素、芍药苷在血、脑微透析探针中的回收率的影响，结果发现，芒柄花素和芍药苷在微透析探针中的回收率会随着温度的升高而增大。廖卫国等[21]研究不同温度(25、30、37、42 ℃)对阿魏酸、川芎嗪在微透析探针中的回收率的影响，结果发现，在相同条件下，随着温度升高，阿魏酸和川芎嗪在脑微透析探针中的回收率增大。邓显仪等[22]研究不同温度(25、37、45 ℃)对雪上一枝蒿甲素在微透析探针中的回收率的影响，结果发现，温度对探针的回收率有较大的影响，温度升高探针回收率增大。因此，微透析体内实验时，需要保持动物体温稳定，从而提高探针回收率的稳定性，保证实验结果准确可靠。

1.10探针类型 微透析探针形式多样，按其几何构造可分为同心圆形探针、线性探针、柔性探针和分流探针。不同类型的探针适用于不同部位取样，回收率也会不同。张岩等[23]采用林格氏液为灌流液，研究氧化苦参碱在同心圆形探针和线性探针中的回收率，结果发现，相同条件下同心圆形探针的回收率明显高于线性探针的回收率。

2 提高脂溶性药物回收率的方法

微透析实验中，通常采用降低灌流液流速、选择合适的探针和灌流液等方法提高探针的回收率。但由于脂溶性药物在水溶性灌流液中溶解度低的特性，加上实验条件和检测手段的限制，实验过程中，通常采用改变灌流液的成分和pH值等来提高脂溶性药物在探针中的回收率。

目前，微透析实验常用的灌流液有林格氏液、人工脑脊液、PBS和柠檬酸-葡萄糖溶液[24]等。这些灌流液大多属于水溶性溶液，探针对水溶性药物回收率较高。但使用水溶性灌流液很难较好地溶解脂溶性药物，会导致探针回收率低、检测困难和实验误差大[25]。此外，微透析探针对脂溶性成分具有一定的吸附性，也会导致探针回收率降低[26]。

2.1改变灌流液的成分 研究发现，向常用灌流液中加入灌流液改性剂，如环糊精、乙醇、脂肪乳、牛血清白蛋白、抗体或其他亲和物质能一定程度上消除脂溶性药物与微透析探针膜的结合或增加药物在灌流液中的溶解度，从而提高脂溶性药物在探针中的回收率。

2.1.1加入助溶剂 灌流液中加入环糊精(α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精)等助溶剂可以与脂溶性药物形成水溶性复合物，消除脂溶性药物与探针膜的结合，从而增加脂溶性药物在探针中的回收率[27]。Khramov A N等[28]研究发现，向微透析灌流液中添加助溶剂环糊精(β环糊精或羟丙基-β-环糊精等)后，环糊精可以与药物形成络合物，加快药物透过探针透析膜的速度，从而提高脂溶性药物(丙咪嗪、地昔帕明、阿米替林、卡马西平和异丙嗪)在微透析探针中的回收率。Fletcher H J等[29]研究脑啡肽在微透析探针中的回收率，结果发现，在灌流液中添加助溶剂环糊精可将脑啡肽的回收率提高2倍。

2.1.2加入潜溶剂 脂溶性药物在水溶性灌流液中的溶解度较低，导致药物在微透析探针中的回收率偏低，加入乙醇等潜溶剂可增加脂溶性药物在灌流液中的溶解度，从而提高药物在探针中的回收率。因此，可通过向常用灌流液中添加适当比例的乙醇从而增大药物在微透析探针中的回收率。管咏梅等[30]以乙醇体积分数为30%的生理盐水溶液、林格氏液和PBS为灌流液，采用LC-MS/MS法研究雷公藤甲素在微透析探针中的回收率。结果显示，以上述3种溶液为灌流液时，雷公藤甲素在微透析探针中的回收率分别为43.79%±5.53%、38.39%±2.46%、32.50%±1.76%，说明以乙醇体积分数为30%的生理盐水溶液为灌流液时雷公藤甲素在微透析探针中的回收率最高。刘新国等[31]考察灌流液改性剂对环维黄杨星 D在微透析探针中的回收率的影响，结果发现，以乙醇体积分数为30%的生理盐水溶液为灌流液时环维黄杨星 D的回收率最高，且回收率较稳定。

2.1.3加入增溶剂 水包油微乳液作为一种增溶剂，被广泛用于提高脂溶性药物的溶解度[32]，从而提高脂溶性药物在微透析探针中的回收率。水包油型微乳液为液态，液滴外的脂溶性分子可以通过油水界面扩散进入液滴内的油相核心，从而提高疏水性药物的溶解度[33]。由于水包油型微乳具有提高脂溶性药物溶解度的特点，适合用作微透析灌流液，并能增大脂溶性药物的回收率。Zhang Yong Tai等[34]采用聚氧乙烯蓖麻油和二乙二醇单乙基醚作为表面活性剂和助表面活性剂，以油酸乙酯为油相制备成微乳，将微乳与林格氏液按1∶6的比例混合，获得等渗溶液。实验结果表明，以这种溶液为灌流液时脂溶性化合物吴茱萸碱和吴茱萸次碱的回收率分别为58.36%±0.57%、49.40%±0.57%，高于以聚乙二醇(PEG)400体积分数为20%的林格氏液和乙醇体积分数为10%的林格氏液为灌流液时的回收率。Gao Qizhen等[35]研究发现，糠酸莫米松在含PEG400体积分数为40%、含脂肪乳体积分数为5%、20%林格氏液中的溶解度明显高于在林格氏液中的溶解度。同时，与含脂肪乳体积分数为40%、20%林格氏液相比，含脂肪乳体积分数为5%的林格氏液中糠酸莫米松的回收率和传递率均明显提高，且回收率与传递率相等。

2.1.4加入渗透剂 高相对分子质量截留膜的微透析探针可用于相对分子质量大的化合物(如生物活性肽和蛋白质)取样。但较高相对分子质量截留膜中液体容易流失，从而影响分析物的回收率。研究发现，渗透剂如牛血清白蛋白可以降低微透析探针膜的失水能力，显著提高分析物在探针中的回收率。吴黎莉等[8]以PBS、脂肪乳、含 50 g·L-1羟丙基-β-环糊精及含不同质量浓度牛血清白蛋白(5、10、20 g·L-1)的PBS为灌流液，研究醋酸曲安奈德在微透析探针中的回收率，结果发现，以PBS中添加 10、20 g·L-1牛血清白蛋白的溶液为灌流液时，醋酸曲安奈德在探针中的回收率得到较大提高，且回收率和传递率相等。

2.1.5加入亲和物质 在微透析取样过程中，由于蛋白质和肽具有疏水性，导致相对分子质量较大的蛋白质和肽等物质在微透析探针中的回收率较低。在灌流液中加入抗体、肝素等亲和物质能提高其在探针中的回收率。Ao Xiaoping等[36]研究发现，在微透析灌流液中加入抗体包被的微球增加了透析膜中分析物的扩散驱动力，从而使肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-5(IL-5)在微透析探针中的回收率提高4～12 倍。Herbaugh Anthony W等[37]研究发现，灌流液中添加单克隆抗体后，灌流液流速为2.0、1.0 μL·min-1时，趋化因子配体2在探针中的回收率从9.6%±3.4%、12.2%±4.1%提高到37.5%±10.2%、64.8%±11.7%，说明在灌注液中添加游离抗体会增加趋化因子配体2的回收率。Duo Jia等[38]研究发现，向微透析灌流液中加入肝素包被的微球作为亲和剂后，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、单核细胞趋化蛋白-1(CCL2)和正常T细胞表达和分泌因子(CCL5)在微透析探针中的回收率提高2～5倍。

目前，常用的灌流液改性剂，如环糊精、乙醇、脂肪乳、牛血清白蛋白、抗体或其他亲和物质均能在一定程度上消除脂溶性药物与微透析探针膜的结合或增加药物在灌流液中的溶解度，从而提高脂溶性药物在探针中的回收率。但对于某些药物而言，并非所有的灌流液改性剂都能提高其在探针中的回收率。因此，在微透析实验中，应根据实验药物选择能使其回收率提高的灌流液改性剂。

2.2改变灌流液的pH值 微透析灌流液的pH值可影响药物在灌流液中的溶解度及稳定性，从而影响药物在探针中的回收率。因此，可以采用改变灌流液pH值的方法来提高脂溶性药物在微透析探针中的回收率。Tre Emmanuelle S等[39]研究优化灌流液的 pH 值提高脂溶性药物在探针中的回收率。结果发现，酮康唑、克霉唑和维甲酸为脂溶性药物，在生理pH(7.4)条件下溶解度较低，导致它们在探针中的回收率较低。采用pH值为4的灌流液时，酮康唑和克霉唑的回收率分别提高6.9、8.3倍，采用pH值为9的灌流液时，维甲酸的回收率提高2倍。说明对于脂溶性药物，微透析探针回收率较低，可以采用改变灌流液pH值的方法提高探针的回收率。

3 总结与展望

与传统的取样技术相比，微透析技术作为一种新型活体取样技术具有以下优点：(1)可以在不干扰机体正常生命活动的情况下进行在体、实时、在线取样；(2)既可对同一组织进行长时间连续取样，又可对同一动物进行多个部位取样，减少实验动物数量，同时也避免实验动物的个体差异造成的实验误差；(3)采样量小、组织损伤轻，所得数据准确可靠；(4)微透析样品干净，不需要前处理，可以直接进行样品分析；(5)可以直接测定生物体内游离态药物质量浓度；(6)可与多种分析仪器联用[40-42]，实现在线分析，易于自动化。因此，微透析技术在药学研究中显示出巨大的优势。随着微透析技术和现代检测技术的发展，微透析技术越来越多地被应用于脑部[43]、眼部[44]、血液[45]、肌肉[46]、皮肤[47]、肝脏[48]、肿瘤[49]、关节[50]、胆[51]及肺[52]等部位的药动学、药效学、药动学-药效学结合模型中。

微透析技术在药学研究中也存在一定的局限性：(1)药动学实验通常需要通过探针的体内回收率计算药物在体内的实际质量浓度。但由于药物在动物体内的质量浓度未知，只能测定探针传递率，然后用传递率推测探针回收率。对于一种化合物而言，传递率和回收率并不总是相等的。因此，如何解决探针传递率和回收率不相等的问题成为微透析技术在药动学研究中的重点。(2)微透析实验常用灌流液(如生理盐水、林格氏液、PBS、人工脑脊液等)大多属于水溶性溶液，对脂溶性强的药物回收率较低。所以，在进行脂溶性药物微透析实验时，如何选择合适的灌流液，提高探针回收率，确保实验数据准确可靠，成为人们需要研究的问题。(3)由于微透析技术取样的连续性，探针回收率较低，对检测仪器要求较高。常用的检测仪器(如高效液相色谱仪等)灵敏度较低，可能导致实验数据不准确甚至检测不到透析液中的药物，需要灵敏度更高的仪器(如 LC-MS/MS等)才能用于透析液样品的检测。但这些灵敏度高的仪器通常价格较贵，而且使用和维护成本较高。因此，如何提高探针回收率，减少实验成本，成为未来微透析技术研究的重点。相信随着科学技术的不断发展，这些问题将会被解决。