酶联免疫法鉴别乳制品掺假的研究进展

文 / 任倩然 张 昊 郭慧媛 任发政 中国农业大学教育部—北京市共建功能乳品重点实验室

目前市场上一些高档乳制品产量较少，供应量变化大，在利益的驱使下导致乳制品中掺假的违法事件时有发生。为应对这一问题，开发快速可靠的乳制品掺假的鉴别方法就显得十分重要。目前，针对乳制品掺假的鉴别方法主要分为免疫学法和非免疫学法[1]。非免疫学法包括高效液相色谱[2]、毛细管电泳[3]和等电聚焦电泳等[4]。尽管这些方法都各有优点，但存在工作量大，成本高等问题。相比而言，以免疫学为基础的方法就显示出了更多的优势。在过去的几年里，免疫分析法已成功地应用到了乳制品的定量检测和掺假鉴别中，酶联免疫分析法（ELISA）因其快速便捷，成本较低的优点已成为应用最广泛的免疫学方法之一。

1 酶联免疫法

1.1 反应原理

酶联免疫吸附实验的基本原理是：在固相载体（如聚苯乙烯反应板）上包被抗原或抗体后，通过抗原抗体反应使酶标抗体（或酶标抗原）结合到载体上。经洗涤使结合的酶标抗体和游离的酶标抗体分离，洗去游离的酶标抗体（或酶标抗原），加入底物显色。底物显色的程度与在实验中使用的标准物浓度以及被测抗原或抗体的浓度成正比[5]。根据抗原、抗体的亲和力和检测条件，最低可以检测到10 pg/mL的抗原或抗体。

1.2 分类

酶联免疫法是以固相吸附技术为基础的，根据Crowther的分类，可以分为以下4 种：①直接法：抗体或抗原包被于固相载体，直接与酶标记的特异性抗体或抗原结合。②间接法：抗体和包被在固相载体上的抗原发生特异性反应。通过添加酶标记二抗来检测标本中相应的抗原或抗体的量。③双抗体夹心法：其中的直接法，是将特异性抗体（捕获抗体）包被于固相载体后与抗原进行结合，然后加入针对抗原的酶标记特异性抗体（检测抗体），加底物显色进行测定，底物降解的量即为欲测抗原的量。其中，捕获抗体和检测抗体可以是来源相同的血清也可以是来源不同的血清。这种方法要求欲测的抗原必须有2 个可以与抗体结合的位点。而在间接法中，检测抗体和捕获抗体是来自于不同的物种的，而酶标抗体是和特异性检测抗体而不是捕获抗体绑定在一起的。④竞争法：也可分为直接和间接竞争法，2 个反应物（抗体或抗原）和包被的抗原或抗体进行反应，2 个反应物（抗体或抗原）作为竞争者同时参与到该反应中[6]。

1.3 抗体

抗体是进行酶联免疫法的基础，主要分为多克隆抗体和单克隆抗体。第一代抗体是多克隆抗体，即利用抗原免疫动物后获得的抗体；第二代抗体为单克隆抗体，即通过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗原决定簇的抗体。

1.3.1 多克隆抗体的概念及制备方法

多克隆抗体是指用一种包含多种抗原决定簇的抗原来免疫动物，即可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。制备多克隆抗体首先要进行免疫原的制备，包括天然抗原和人工合成抗原，然后用得到的抗原进行动物免疫。为了获取高质量的抗体，除了需制备高纯度的抗原外，还需选择适宜的动物和设计有效可行的免疫方案，免疫后要将免疫血清通过亲和层析、离子交换层析等方法进行纯化，用得到的较纯的血清进行效价、特异性、纯度及亲和力的鉴定。

1.3.2 单克隆抗体的概念及制备方法

单克隆抗体是指由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体，均一度高，特异性强，效价高，少或无交叉反应性。单克隆的制备方法首先也要进行免疫，免疫后进行血清效价测定，之后选择出效价合适的小鼠获得其B淋巴细胞。而要得到单克隆抗体就需要得到能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞。但这种B淋巴细胞不能在体外生长，而实验发现，骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术可将骨髓瘤细胞与上面得到的淋巴细胞二者合二为一，即可得到杂种的骨髓瘤细胞。之后将得到的杂交瘤进行选择，然后运用ELISA方法对抗体进行初筛。将筛得的专一性杂交瘤细胞用有限稀释法克隆化，之后向小鼠体内接种该杂交瘤细胞制备腹水或血清，大量制备单抗，最后将抗体进行纯化鉴定并保存。

2 多克隆抗体酶联免疫法在乳制品掺假检测中的应用

2.1 抗乳清蛋白多克隆抗体的应用

Garc í a等学者报道了使用针对乳清蛋白的多克隆抗体，采用间接ELISA法，定量检测绵羊奶中掺假的牛奶。通过免疫兔子制备抗牛奶乳清蛋白的生物素标记多克隆抗体，并利用绵羊和山羊乳白蛋白消除其与绵羊奶和山羊奶的交叉反应。该方法可以检测到1%～50%的牛奶添加到绵羊奶中。但是，这一方法对于商业上经高温灭菌的牛奶检测限较低[7]。此外，他们还将制备出的抗体与冻干的牛乳清蛋白和绵羊乳清蛋白进行混合反应，选出具有特异性的兔抗山羊乳清蛋白的多克隆抗体，以间接ELISA方法检测，可检测到1%～100%的山羊奶掺入母羊奶中[8]。Sauer等人利用双抗夹心法，用羊抗牛IgG的特异性抗体检测在绵羊奶或山羊奶中掺入的牛奶，得到的抗体与绵羊、山羊的IgG和用辣根过氧化物酶标记的抗体无交叉反应，实验的检测限为0.001%[9]。Garc í a等人利用双抗夹心ELISA法，用兔抗山羊乳清蛋白多克隆抗体定量检测，可以检测到在绵羊奶中掺加的0.5%～100.0%山羊奶。但是对于灭菌后的山羊奶检测结果较低[10]。综上所述，乳清蛋白的免疫原性较好，但其对加热很敏感，当热处理过的牛奶被用来检测时可能会引起假阴性反应。

2.2 抗酪蛋白多克隆抗体的应用

乳制品的高温处理有可能改变其中蛋白质的抗原性，而相对于乳清蛋白，酪蛋白在免疫反应中不会受到加热处理的影响，因此，其更适合在免疫学方法中作为抗原来检测不同种类的加热乳制品。许多学者研究开发出了以针对酪蛋白的多克隆抗体进行ELISA检测的方法。Rodr í guez等人使用间接ELISA方法可以检测到绵羊奶中掺入1%～50%的牛奶，在生物素化后，兔抗牛酪蛋白的多克隆抗体与冻干的山羊和绵羊酪蛋白进行混合，可提高其针对牛奶的特异性[11]。

除利用免疫奶中全酪蛋白产生的多克隆抗体进行检测外，又发展了利用酪蛋白单体对应的多抗进行乳制品掺假的鉴别，在一定程度上提高了检测限。如兔抗牛γ3酪蛋白和鸡抗牛γ3酪蛋白的多克隆抗体就被Richter等人在间接竞争ELISA法中使用。实验通过固相吸附含有纤维蛋白溶解酶处理的绵羊酪蛋白来降低天然抗血清的交叉反应，该方法的检测限为0.1%，并且可特定的在以绵羊和山羊奶为原料的干酪中鉴别牛奶，高温处理对结果不会产生影响[12]。

2.3 抗乳蛋白多肽段多克隆抗体的应用

对于针对合成多肽的多克隆抗体，相当于定义一段可作为免疫抗原的酪蛋白或乳清蛋白的特异性区域（即肽段），合成后，以其作为人工抗原进行免疫，产生的抗体被用来检测在绵羊和山羊奶干酪中的牛奶。Bitri等人就采用了一种竞争ELISA方法，用来检测牛酪蛋白巨肽（CMP），从而来鉴别绵羊或山羊奶和干酪中是否混入了生的或者经过加热处理的牛奶。他们用化学合成的牛κ酪蛋白139～152肽段做抗原免疫产生兔抗多克隆抗体，纯化后的抗原（牛CMP）通过酶标板被固相吸附，然后和一定量的抗体进行特异性反应，可以检测掺入0.25%～64.00%的牛奶[13]。Rolland等人化学合成了牛αs1酪蛋白的140～149肽段，该肽段比绵羊αs1酪蛋白缺失部分多了2 个氨基酸，并以此肽段免疫产生的特异性多克隆抗体用间接ELISA法进行检测[13]。通过这种方法可以检测到在绵羊奶中0.125～64.00%的牛奶和在干酪中的0.5～25.0%的牛奶，并且加热处理和干酪的成熟过程不会对结果产生显著的影响[14]。

3 单克隆抗体酶联免疫法在乳制品掺假检测中的应用

多克隆抗血清是由大量单克隆抗体组成的，这些单克隆抗体有不同的特异性抗原决定簇，因而要得到特异性高的抗体就需要大规模地亲和吸附和使用其它异种蛋白来进行筛选[15]。

3.1 抗乳清蛋白单克隆抗体的应用

Levieux等人采用针对牛β乳球蛋白的单克隆抗体，利用双抗夹心ELISA法对山羊和绵羊奶中的牛奶进行了检测，此方法有很高的特异性和灵敏度并且重复性较好，可以检测到1 份牛奶掺入到100 000 份绵羊奶及山羊奶中[16]。Negroni等人采用一种针对牛β乳球蛋白的单克隆抗体（MAb BLG-88N）作为捕获抗体在改良双抗夹心法中使用，可以检测到0.03%的牛奶掺入到山羊奶中[17]。

3.2 抗酪蛋白单克隆抗体的应用

Anguita等人研究发现，β酪蛋白在牛所有的酪蛋白中都显示出较高的抗原性[18]。因此，他们以牛β酪蛋白做抗原得到单克隆抗体（MAB AH4），使用间接ELISA法分别检测未经处理的、经过巴氏杀菌和超高温灭菌的牛奶在山羊奶或母羊奶中的掺入情况，检测限可以达到0.5～10.0%[19]。山羊αs2酪蛋白被认为是山羊酪蛋白中免疫反应最强的，因此Haza等人针对山羊αs2酪蛋白制备单克隆抗体[20]，实验所得的单抗与绵羊和牛的全酪蛋白均没有明显的交叉反应，其中的MAb B2B显示出很强的专一性，并且其反应结果不会受到加热处理的影响。应用该单抗进行间接ELISA检测，可检测到0.5～15.0%的山羊奶掺入母羊奶中[21]。之后，Haza等人又分别采用间接ELISA法和间接竞争ELISA法使用同一抗体定量检测了山羊奶干酪掺入到母羊奶干酪中。结果表明，2 种方法可分别检测1%～25%和0.5%～25.0%的山羊干酪掺入到母羊干酪中，并且发现检测结果不会受到奶的加热处理或干酪成熟的影响[22～23]。

4 小结

综上所述，ELISA方法针对无论是微量的掺入还是经过高温处理的乳制品都可以进行准确地掺假鉴别。在制备单抗的过程中，来自不同物种的蛋白质之间的交叉反应可以采用杂交瘤技术被消除，并且能连续不断地产生具有专一性的抗体。这些抗体特异性地识别牛奶中的某种蛋白质或者是某个特异性肽段，对进行不同种类乳制品的检测具有重要意义，应用酪蛋白做抗原也可以克服在干酪成熟中干酪蛋白质水解对其抗原特性的影响。总之，针对乳制品中的掺假鉴别，ELISA法已经发展成为一种非常灵敏、可靠的分析方法。今后的发展趋势是进一步提高其特异性和灵敏度，通过与基因方法相结合的方式更加有效地鉴别乳制品中的掺假。

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