玻璃体内注射Infliximab对实验性自身免疫性葡萄膜炎的治疗作用

刘 莹 李 林 高晓唯 张振华 杨永利 赵旭东

葡萄膜炎是常见的眼部致盲性疾病，种类繁多，病因和发病机制尚未完全明确，一般认为多与自身免疫性疾病有关［1-2］。目前对葡萄膜炎还没有明确或者有效的治疗方案。传统药物一般首选糖皮质激素［3］。近年来研究发现Infliximab与可溶性和膜结合型TNF-α结合后可抑制肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)活性，减轻炎性损害，现多用于治疗前葡萄膜炎和后葡萄膜炎。本实验通过利用牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)作为异体抗原，制备新西兰大白兔BSA诱导的实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis，EAU)模型，探讨玻璃体内注射Infliximab对EAU的治疗作用。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康成年雌性新西兰大白兔32只，体质量1.0～1.5 kg，购自新疆医科大学实验动物中心。采用随机数字表法将32只兔随机分为3组:模型对照组和正常对照组各8只，治疗组16只。正常对照组不造模，模型对照组和治疗组兔双眼均造模。

1.2 动物模型的建立 参照文献［4］的方法:用电子天平精确称量4～8℃保存的BSA粉剂4 g，用100 mL无菌注射用水充分溶解，配制为40 g·L－1BSA溶液。4 g·L－1盐酸奥布卡因眼液表面麻醉后，玻璃体内注射40 g·L－1BSA溶液0.25 mL(注射后以无菌棉签按压注射孔5 min，防止药液外溢)。1周后，再用同样的方法配制20 g·L－1BSA溶液，兔耳缘静脉注入2.50 mL。1周后观察兔眼情况，出现虹膜血管扩张、充血，纤维素渗出，瞳孔膜闭等炎症表现，为造模成功。

1.3 药物注射方法 在造模成功后次日，各组分别行玻璃体内注射1次，正常对照组和模型对照组注射生理盐水0.1 mL，治疗组注射10 g·L－1Infliximab(西安杨森制药有限公司)0.1 mL。

1.4 兔活体眼部检查 分别于造模前及造模后5 d、10 d、15 d裂隙灯显微镜和直接检眼镜下观察兔眼部表现，并记录房水闪辉情况。房水闪辉分级标准［5］:无房水闪辉;房水闪辉(+):微弱的房水闪辉;房水闪辉(++):中度的房水闪辉，可以辨别虹膜纹理;房水闪辉(+++):显著的房水闪辉，虹膜纹理和晶状体模糊;房水闪辉(++++):严重的房水闪辉，房水呈凝固状态，伴大量纤维素性渗出物。

1.5 ELISA检测和组织病理学观察 造模前及造模后5 d、10 d、15 d随机处死模型对照组和正常对照组兔各2只，治疗组4只。前房穿刺，抽取房水0.1～0.2 mL，放入冻存管内，于－80℃冰箱中保存。待标本全部收集完后，按照ELISA试剂盒(武汉博士德生物公司)说明书进行操作，检测房水中TNF-α和白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)的含量。在上述4个时间点抽取房水后，摘除兔双侧眼球，体积分数10%甲醛固定，24 h后石蜡包埋切片，苏木精-伊红染色，行组织病理学观察。

1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件进行统计学处理。ELISA测定结果用±s表示，差异用方差分析进行检验;裂隙灯下房水闪辉的观察用秩和检验，将房水闪辉的5个等级数量化，数值用平均秩号，比较各组平均秩号的大小。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 兔活体眼部表现 正常对照组前房清亮，虹膜纹理清晰可见，瞳孔圆，红光反射存在，在任何阶段均未出现过房水闪辉。模型对照组和治疗组在造模前均无房水闪辉。按照无房水闪辉、房水闪辉(+)、房水闪辉(++)、房水闪辉(+++)、房水闪辉(++++)分级顺序，在造模后5 d，模型对照组兔眼的数目分别为 0、0、1、2、9，治疗组分别为 0、0、4、8、12，两组通过秩和检验比较，差异无统计学意义(Z=－1.37，P＞0.05)。造模后10 d，模型对照组兔红光反射消退，虹膜血管明显扩张、充血，瞳孔膜闭，瞳孔区可见大量的纤维素样渗出(图1A)。治疗组兔虹膜血管中度扩张、充血，瞳孔大小正常，前房内仅见少量纤维素样渗出，红光反射轻度模糊(图1B)。根据上述房水闪辉分级顺序，造模后10 d，模型对照组数目分别为 0、1、1、1、5，治疗组为 0、8、5、2、1;两组比较差异有统计学意义(Z= －2.69，P=0.00)，且模型对照组的平均秩号(17.75)大于治疗组(9.88)。造模后15 d，模型对照组数目分别为0、0、1、1、2，治疗组为 3、3、1、1、0，两组比较差异也有统计学意义(Z= －2.43，P=0.01)。

2.2 ELISA法检测房水TNF-α和IL-2的含量

正常对照组、模型对照组和治疗组4个时间点房水中TNF-α和IL-2含量变化见表1-2。由表知，3组造模前房水中TNF-α和IL-2含量无差异。造模后5 d，模型对照组和治疗组房水中TNF-α和IL-2含量均高于正常对照组(均为P＜0.05)，而模型对照组和治疗组比较差异无统计学意义(均为P＞0.05);造模后10 d，模型对照组房水中TNF-α和IL-2含量继续增加，而治疗组含量均明显下降(均为P＜0.05);造模后15 d，模型对照组房水中TNF-α和IL-2含量轻度下降，治疗组继续下降。造模后10 d、15 d，治疗组TNF-α和IL-2含量均明显低于模型对照组(均为 P=0.00)。

Figure 1 At 10 days after modeling，examination of rabbit eyes.A:In model control group，the iris blood vessels expanded obviously and a large amount of cellulose could be seen obviously in the pupil.B:In treatment group，the iris blood vessels expanded moderately and only a little cellulose could be seen in the anterior chamber 造模后10 d兔活体眼部检查。A:模型对照组兔虹膜血管明显扩张、充血，瞳孔区可见大量纤维素样渗出;B:治疗组兔虹膜血管中度扩张、充血，瞳孔大小正常，前房内仅见少量纤维素样渗出

表1 正常对照组、模型对照组和治疗组4个时间点房水TNF-α含量比较Table1 Contents of TNF-α in aqueous humor among normal control group，model control group and treatment group at the four time points (ρ/ng·L－1)

表2 正常对照组、模型对照组和治疗组4个时间点房水IL-2含量比较Table2 Contents of TNF-α in aqueous humor among normal control group，model control group and treatment group at the four time points (ρ/ng·L－1)

2.3 组织病理学观察 正常对照组、模型对照组和治疗组造模前双眼均没有任何病理改变。在造模后5 d、10 d、15 d光学显微镜下观察3组的组织病理学切片显示有差异，这种差异在造模后10 d最明显:模型对照组视网膜各层结构紊乱，层次不清晰，可以观察到炎细胞浸润，组织结构破坏(图2A);而治疗组的视网膜结构基本完整，层次基本清晰，炎细胞浸润较少(图2B)。正常对照组始终未见任何病理改变。

3 讨论

葡萄膜炎是威胁视力的严重疾病，目前用于研究葡萄膜炎的动物模型通常有两种:内毒素诱导的葡萄膜炎和EAU。前者通常用来研究人类全葡萄膜炎或急性前葡萄膜炎，而EAU常用来研究人类全葡萄膜炎或后葡萄膜炎［6-7］。本实验用BSA作为异体抗原，玻璃体内、耳缘静脉两次注射法免疫新西兰大白兔，成功建立EAU模型，为研究Infliximab对葡萄膜炎的治疗提供了重要的工具。

目前用于治疗葡萄膜炎的首选药物为糖皮质激素，常用药物有曲安奈德和地塞米松。糖皮质激素具有抗炎和免疫抑制的疗效，能选择性地作用于免疫活性细胞亚群或是某一环节，暂时阻止疾病的发生发展，减轻水肿、渗出并抑制炎性介质的释放［8-9］。但是长期应用常常会导致全身副作用，如向心性肥胖，血压、血糖升高，加重消化性溃疡，诱发或加重感染，精神失常，伤口愈合延迟，骨质疏松等［9-10］;眼部毒副作用如眼压升高、晶状体后囊膜混浊、角膜上皮毒性等［10］。

研究发现葡萄膜炎是由辅助性T(Th)细胞介导的自身免疫性疾病［11-12］，而 TNF-α 由 Th细胞、巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和内皮细胞分泌。TNF-α是Th1反应的主要炎症介质，而TNF-α拮抗剂可以抑制Th细胞，从而进一步抑制浸润性巨噬细胞活化，保护葡萄膜炎中的组织不受破坏。

Figure 2 The histopathological examination at 10 days after operation(HE，×100).A:The structure of each retinal layer in model control group was unclear，arranged disorderly and the inflammatory response was clear.B:The structure of each retinal layer in treatment group was clear and the inflammatory response was relieved obviously 造模后10 d兔眼球组织病理学切片像(HE，×100)。A:模型对照组视网膜各层结构紊乱，层次不清晰，炎症明显;B:治疗组视网膜各层结构基本完整，层次基本清晰，炎症明显减轻

生物制剂Infliximab是TNF-α人鼠嵌合单克隆抗体的拮抗剂，它与可溶性和膜结合型TNF-α结合后抑制TNF-α活性，减轻炎性损害。Infliximab在风湿病、克罗恩病等方面应用比较多，在这些方面主要的给药途径是全身静脉用药，但全身用药的不良反应较多，例如可加重心脏损害，导致多发性硬化，增强传染病的活动性等。研究表明，在眼科领域只有玻璃体内注射会减少全身并发症的发生几率，同时增加视网膜和脉络膜的有效药物浓度［13-14］，所以本实验我们采用玻璃体内注射Infliximab应用于兔葡萄膜炎的治疗研究中，对比观察正常对照组、模型对照组和治疗组兔的眼部表现和组织病理学改变。结果显示，治疗后治疗组房水闪辉数目少于模型对照组，同时组织病理学表现明显减轻，这充分说明治疗组对炎症起到了很好的控制作用。通过ELISA法检测兔房水中TNF-α和IL-2的含量，治疗后治疗组含量均明显低于模型对照组，充分说明了Infliximab能明显降低房水中TNF-α和IL-2的水平，从而减轻了眼部组织的损害，改善了葡萄膜炎的病情。Infliximab为葡萄膜炎的治疗开辟了新的思路和方法。

当然本实验存在一些不足之处，如样本量有限致房水的采集数量有限，这样就无法检测房水细胞中的多个因子，限制了对其他相关细胞因子的研究。现在有一种新的技术，即BD公司的液相多重蛋白定量技术(BD CBA)，可以同时检测多种细胞因子，但是需要用流式细胞仪，价格也较贵。Infliximab对葡萄膜炎的治疗多为小样本临床观察，玻璃体内注射的剂量、次数、间隔时间及它的安全性和长期效果有待于进一步实验研究。Infliximab的毒副作用及价格昂贵也对该药的临床应用起到了限制。

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