Avastin-壳聚糖纳米粒的制备△

周 楠 黄 潇 李玉珍 程金伟 蔡季平

目前，各种阻断血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)通路及其受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)的抗新生血管生成的研究已成为临床和基础研究的热点。以VEGF作为治疗靶点，应用VEGF单克隆抗体贝伐单抗(Bevacizumab，Avastin)抑制新生血管生成［1-2］，是目前治疗新生血管性疾病的又一新策略。在各种靶向VEGF/VEGFR的新生血管生成抑制剂中，Avastin(即Bevacizumab)和Lucentis(即ranibizumab)作为新型的抗VEGF人源化的单克隆抗体，主要通过中和VEGF、阻断其和内皮细胞上的受体结合而发挥作用，减少异常血管生成。Avastin是第一个被美国FDA批准的通过抑制新生血管生成而发挥抗癌作用的新药。

壳聚糖(chitosan，CS)药物纳米控释系统是可有效控制药物传递和控释的载体，可提高药物的稳定性，使药物在局部保持较高浓度，增加药物的吸收，且可打开上皮、黏膜细胞间的紧密连接，增强药物的渗透作用［3］。应用于药物的器官靶向、提高DNA转染率、多肽蛋白类药物的非注射途径给药以及注射给药的长效制剂研究，尤其在药物抗肿瘤血管生成的研究中具有非常广阔的应用前景。而且CS、CS衍生物本身具有多种生物学活性，作为药物辅料和药物结合在一起将具有双重的治疗效果。

本实验设计与合成了以Avastin为模药，以CS为载体的纳米粒制剂(Avastin-CS-NP)，采用高压匀化优化制备工艺，并对其物理特性、缓释性能进行初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器 CS(1～100 g·L-1，脱乙酰度大于92%，相对分子质量(60～88)×106，上海如吉生物科技公司);Avastin(上海罗氏制药公司);多聚磷酸钠(TPP，1～50 g·L-1，上海旭东海普药业公司);Micro-BCA蛋白浓度检测试剂盒(美国 Pierce公司);其余试剂均为国产分析纯。

SHIMADZU UV-2201紫外分光光度仪(日本岛津);Nano-S Malvern动态光散射纳米粒径测试仪(英国马尔文公司);BECKMAN NVT90低温超高转速离心机(美国贝克曼公司);透射电子显微镜JEM-2010(日本电子株式会社);JEOL Ltd.透析袋(可滤过相对分子质量为10×103，上海医药试剂公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 Avastin-CS-NP 的制备 Avastin-CS-NP 制备条件:Avastin浓度为25 g·L-1，CS/TPP质量比为3∶1，T 为(20 ±2)℃，pH 5.5。采用离子胶凝法，步骤如下:(1)配制25 g·L-1的Avastin溶液;(2)滤膜法筛选出相对分子质量大于80×103的CS;CS经1 mol·L-1NaOH纯化(1 g CS:10 mL NaOH液，pH 8.0)，彻底洗脱、烘干;(3)取一定量纯化后的CS溶解于0.1 mol·L-1稀醋酸中，制得 CS溶液;以蒸馏水溶解多聚磷酸钠，配制胶联剂(TPP)溶液;取适量(1)中配制的药物溶液分散于制得的CS溶液中，调整pH=5.5;(4)将配制的TPP溶液，缓慢滴加于含药物的CS溶液中。轻轻搅拌，室温反应10 min，即得Avastin-CS-NP;(5)将所制得的Avastin-CS-NP放入高压乳匀机，在(10～100)×106Pa压力下进行匀化，得到粒径分布范围较窄的Avastin-CS-NP。

1.2.2 纳米粒粒径及分布测定 室温下取适量Avastin-CS-NP混悬液，置Nano-S粒径测定仪中测定载药纳米粒的粒径分布及平均粒径。

1.2.3 观察纳米粒形态 滴1～2滴Avastin-CS-NP混悬液于铜网上，20 g·L-1磷钨酸溶液负染色，室温晾干，于透射电镜下观察纳米粒的形态。

1.2.4 包封率和载药量的测定

1.2.4.1 MicroBCA 法蛋白浓度检测及标准曲线绘制 (1)配制BCA工作液:分别取A液1.25 mL，B液1.2 mL，C液0.05 mL充分混匀，按A 液:B液:C液=25∶24∶1的比例配制。(2)配制标准蛋白溶液:取标准蛋白BSA(2 g·L-1)溶液，分别稀释成以下浓度:0.125 g·L-1、62.5 ×10-3g·L-1、31.25 ×10-3g·L-1、15.625 ×10-3g·L-1、7.812 5 ×10-3g·L-1、3.906 25 ×10-3g·L-1。(3)取 96 孔板，在1-6孔中分别加入100 μL上述浓度的BSA溶液，在第7孔中加入100 μL蒸馏水，设为对照孔。在1-7孔中分别加入100 μL BCA工作液，充分混匀。(4)将96孔板放入37℃水浴锅中孵育2 h。设定630 nm为参比波长，570 nm为测定波长，用酶标测定仪测定各孔吸光度(OD)值。(5)测得Avastin上清液OD值代入标准曲线。

1.2.4.2 包封率和载药量的计算 取Avastin-CSNP混悬液适量，4℃超速离心45 min(20 000 r·min-1)，小心提取上清液测定紫外吸收度，测得上清液中药物浓度计为Cb(g·L-1)，按投药量计算药物的初始浓度，计为C(g·L-1)，CS空白纳米粒的初始浓度计为M(g·L-1)。包封率计算公式:EE=(C-Cb)/C×100%;载药量计算公式:LC=(CCb)/M×100%。

1.2.5 Avastin-CS-NP的体外释放实验 取一定浓度的纳米粒子，选择 pH 7.4的0.1 mol·L-1PBS溶液为释放介质，加入适量Avastin-CS-NP于溶液中使其充分分散，37℃ 130 r·min-1振摇2 d，分别于2 h、4 h、8 h、16 h、32 h、48 h、96 h 取样1 mL，后续每天取样1 mL离心后取上清液测定药物浓度，补充同体积蒸馏水，进行体外释放实验，计算公式如下:累计释放率=(第n次取样浓度×释放系统总体积+∑n-1次取样浓度×每次取样体积)/总药量。

2 结果

2.1 Avastin-CS-NP的形态、粒径分布 制得的Avastin-CS-NP悬液外观呈乳白色的半透明乳胶状液体。透射电镜下纳米粒子呈圆或类圆形，大小较为均匀，无明显聚集(图1)。动态光散射纳米粒径测试仪测纳米粒子大小，平均粒径为88.9 nm，见表1。

Figure 1 Transmission electron microscope showed good distribution of avastin nanoparticles(×20 000) 实验制得的单分散的纳米颗粒，透射电镜下具有良好的分散形态(×20 000)

表1 Avastin-CS-NP粒径大小及分布Table1 Diameter and distribution of Avastin-CSNP

2.2 纳米粒的载药量与包封率 标准曲线的绘制:设630 nm为参比波长，在570 nm波长处测定标准品紫外吸收度，代入回归方程，见图2。实验测得Avastin-CS-NP的包封率、载药量分别为83.4%和10.4%。

2.3 体外释放曲线 Avastin-CS-NP的累积释放曲线见图3。图3显示了Avastin-CS-NP中Avastin的体外释放行为，具有明显的缓释性能。载药纳米粒在最初8 h内，释放速度较快，突释约25.70%，随后逐渐减缓，为缓慢持续地释放，但以不同的速率进行，96 h内共释放80% ～90%。

Figure 2 Standard curve of Avastin-CS-NP Avastin-CS-NP标准曲线

Figure 3 Dissolution curve of Avastin-CS-NP Avastin-CS-NP释放曲线

3 讨论

本研究以CS为药物载体，采用离子胶凝法制备纳米粒，该方法具有快速简便、成本低、可操作性强等特点，为国内首次关于Avastin纳米粒的相关研究报道。Avastin-CS溶液中加入 TPP后，瞬间形成Avastin-CS-NP。Avastin通过吸附作用载于纳米粒子之上。由于蛋白质大分子具有复杂的三维立体结构，在不同的溶液中可折叠或打开，与CS阳离子发生相互作用后形成复杂的包裹，分子构象、静电作用及溶解条件都对其有影响。

CS是聚阳离子电解质，由于静电斥力在溶液中形成分散构象，大分子蛋白表面的羧基与伸展的CS链上的氨基在某些位点上形成H键，在pH 5.5的溶液中仍然保持紧密的三维结构和分子内部的疏水核心。因此，蛋白质分子的吸附作用并不能完全中和CS分子表面的阳性电荷，CS分子表面仍有较多的游离氨基未被结合。TPP作为交联剂，与CS分子及蛋白质分子上的游离氨基结合形成H键，发生分子内和分子间胶联即生成结构紧密的Avastin-CS-NP。

同时，CS溶液需要在特定的浓度范围内，与TPP具有一定的质量比才能生成纳米粒子［4-6］。TPP浓度一定时，随着CS浓度增加，成球越来越难，可能是由于CS溶液黏度增大，链的缠绕妨碍了CS分子间胶联成球;也可能TPP的量相对不足，不能胶联成球。CS浓度一定时，TPP浓度增加，成球越来越容易，TPP浓度增加到一定程度即生成沉淀，大量的CS与TPP胶联形成大的颗粒。

3.1 包封率及其影响因素 包封率是衡量纳米粒子性能的一个重要指标，与药物缓释特性密切相关。目前国内外尚无Avastin-CS-NP的报道，而我们制备工艺已能达到83.4%的包封率，结果较为满意。

3.1.1 CS相对分子质量对包封率的影响 CS链在溶液中的分散长度与其相对分子质量相关。CS分子链在pH 5.5溶液中由于氨基间的静电斥力得以充分展开，长的CS链可提供更多的反应位点，与蛋白质分子结合形成H键。此时，蛋白质分子与氨基结合不存在严重的空间位阻［7］，蛋白质复杂的三维结构在溶液中也并未充分展开，在不同的溶液中膨胀性不同。本研究选用了相对分子质量较高的CS为载体，所得包封率较高。

3.1.2 CS的脱乙酰度对包封率的影响 CS链上的氨基内在反应性相同，故CS对蛋白质的包裹受其脱乙酰度的影响［7］。我们使用NaOH纯化提高CS脱乙酰度，CS阳离子与蛋白质多肽链(包含阳性、阴性电荷功能簇)相互作用，而蛋白质分子的疏水区在水溶液中则折叠于三维结构内部。

3.1.3 CS浓度对包封率的影响 加入的CS浓度高时，溶液的黏滞性增加，阻止了蛋白质分子在CS链上的运动，是包封率下降的主要因素［8］。

3.1.4 CS/TPP的质量比对包封率的影响 CS/TPP质量比越大包封率越下降。可能由于当CS浓度一定时，TPP量增加，溶液pH增高，随之而来的蛋白质分子表面总的负电荷增多，使得CS分子与蛋白质分子间的静电相互作用增强，吸附力下降［9］。

3.1.5 Avastin的浓度对包封率的影响 蛋白质浓度增加，包封率升高。在恒温下，蛋白质的吸附、包裹在静电相互作用下遵循饱和动力学［10］。随浓度增加，蛋白质包裹呈现与浓度相关的线性增加，在高浓度下达到峰值。故在蛋白质饱和浓度下提高蛋白质的包封率是有可能的。我们使用25 g·L-1的Avastin溶液获得较高的包封率。

3.2 影响药物从纳米粒载体中释放的因素 目前仍没有一个可靠的模型来模拟或预测药物的释放行为，且粒子在体外模拟释放环境和动物体内的释放环境有所不同。研究表明，载药纳米粒释放为初始爆发释放，形成突释，在其后较长的一段时间以恒定的速率释放。释放机制一般认为有三种:蛋白质分子从粒子表面解吸;从膨胀的分子基质上扩散;聚合物降解后释放。多数情况下三种机制同时发生或在药物释放的不同时段某一种机制起主要作用［11］。

突释是由靠近粒子表面的蛋白质分子快速扩散引起［11］。纳米粒子具有很大的比表面积，突释时，吸附的蛋白在接触释放介质后瞬间溶解，粒子内层基质中的蛋白也遵循该机制，一旦粒子发生膨胀、水解，蛋白质分子在水解作用下分离扩散，即形成持续缓慢的释放。故缓释中的蛋白质分子紧密结合于粒子结构内部，必须通过完全解离才能从膨胀的分子结构上脱离。且CS分子聚合链是多重H键，在蛋白质分子释放前必须打破此H键。Avastin的分子链要比纳米粒子的粒径长，它很难在短时间内穿过纳米粒子的表面或孔隙扩散出来。故Avastin的释放过程实际是蛋白质与CS的解吸过程。

3.2.1 CS相对分子质量对释放的影响 Agnihotri等［12］在关于CS纳米粒子的综述中指出:相对分子质量可能对蛋白质和多肽的释放有影响。相对分子质量大的CS制成的粒子粒径大，对突释影响较大［7］。本研究中载药纳米粒8 h内突释明显，约25.70%，后续的释放需要 Avastin-CS-NP的膨胀、降解。

3.2.2 载药量对释放的影响 本研究所得纳米粒子的载药量为10.4%。药物在载体中的浓度即载药量是非常重要的影响因素，释放速率通常取决于药物浓度梯度。药物载药量高，纳米粒子与释放介质的浓度梯度大，扩散速度随之增大。

3.2.3 CS浓度对释放的影响 CS浓度和Avastin释放速度之间不成线性关系。CS浓度增大，溶液黏滞性增强，使得CS分子、蛋白分子在与TPP作用后形成更强的交联，结构紧密，粒子膨胀性下降，从而影响了Avastin的释放。与CS载小牛血清白蛋白的释放研究结果相同［10］。

3.2.4 CS脱乙酰度、Avastin浓度对释放的影响

脱乙酰度对释放速度是个重要的影响因素，甚至可能比载药量的影响更为重要［7］。对于相同相对分子质量的CS，高脱乙酰度含有更多的氨基，与三聚磷酸根离子胶联形成更紧密的结构，使得纳米粒子表面的渗透性降低，从而延缓Avastin的释放速度。

Avastin浓度高，形成粒子粒径增大，粒子总表面积增加，吸附的Avastin分子增多，同时Avastin分子与粒子间的黏合较疏松，释放增加。相应较低的蛋白质浓度，Avastin分子更易与CS分子形成H键，影响释放。

3.3 小结 离子胶凝法制备工艺简单、可操作性强。CS纳米粒子黏附性好、粒径小，可使活性大分子药物顺利渗透黏膜组织，尤其适合于敏感蛋白质大分子的运载［3］。CS纳米粒子应用于生物大分子药物载体的研究，已引起国内外的广泛关注。但以CS为药物载体包裹Avastin、延长药物作用时间、发挥抗血管生成作用的研究目前尚少。

本实验采用无毒性的CS为药物载体材料，以离子胶凝法制得Avastin-CS-NP，外观形态较为圆整，呈单分散状态，粒径分布较窄，平均粒径在100 nm以下。体外释放实验初步验证药物在CS纳米粒的运载下，体外稳定性较好，其活性可得到保持。为后续的临床药效学研究打下坚实的基础。

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