色素上皮衍生因子的表达与早期糖尿病大鼠视网膜血管形态学的改变△

刘宁宁 才 娜 陈 蕾

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)在糖尿病患者中是常见的微血管并发症，而且在发达国家也是最常见的致盲原因。临床流行病学统计DR的发病率高达38% ～90%［1］。新生血管形成是DR主要的病理性改变，并且是其致盲的主要原因。而糖尿病导致 DR发病的机制十分复杂，目前尚未完全明了。研究发现新生血管形成因子与抑制因子之间的平衡失调是新生血管形成的重要机制，抑制血管增生已经成为治疗这类疾病的新靶点［2］。色素上皮细胞衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)是目前最有效的血管增生抑制剂之一［3］。本文利用链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导糖尿病大鼠模型，用视网膜消化铺片法观察微血管变化，原位杂交技术检测PEDF mRNA在大鼠模型中的动态表达，探讨PEDF在新生血管形成中的作用及其与血管本身器质性改变的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 12周龄健康Wistar大鼠48只(96眼)，雌雄不限(中国医科大学实验动物中心提供)，体质量180～220 g。随机分成糖尿病1个月组(DM1)、3个月组(DM3)、6个月组(DM6)，正常对照1个月组(CON1)、3个月组(CON3)、6个月组(CON6)，每组各8只大鼠。实验动物饲养于该中心的标准化饲养房，并饲以标准颗粒饲料。铁笼喂养，不限制食水，自然昼夜光线照明。室内通风良好。相对湿度为40% ～70%，室温保持在18～20℃。

1.2 STZ诱导糖尿病大鼠模型 按60 mg·kg-1的剂量对糖尿病各组大鼠行一次性腹腔注射STZ(美国Sigma 公司产品，临用前用0.1 mol·L-1、pH 值4.2 的柠檬酸缓冲液溶解，配制成20 g·L-1STZ溶液)，注射后1周检测定性尿糖和血糖。尿糖在+++以上、血糖＞16.7 mmol·L-1者为糖尿病大鼠。成模后每周测定一次定性尿糖，每个月测定一次血糖。

1.3 取材 分别取每组大鼠各8只，过量麻醉处死后立即取出眼球，左眼用于视网膜消化铺片，进行组织学观察;右眼进行PEDF mRNA的原位杂交。

1.4 视网膜血管消化铺片的制作与观察 左眼眼球用体积分数10%甲醛溶液固定48 h，参照张惠蓉等［4］介绍的方法制作大鼠视网膜血管消化铺片，常规PAS染色。将标本置于光学显微镜下，随机取5个视野，油镜下计数每个视野中周细胞数量，取其平均值，所有数据均行统计学处理。

1.5 PEDF mRNA的原位杂交 组织切片用胃蛋白酶消化后，滴加预杂交液，37℃下预杂交4 h，恒温箱37～42℃孵育4 h;滴加20 μL杂交液，37℃下杂交过夜;杂交后洗涤，滴加生物素化鼠抗地高辛后，滴加生物素化过氧化物酶，DAB显色;随机取5个视野，光镜下观察PEDF mRNA在不同病程的糖尿病大鼠以及正常对照组大鼠视网膜的表达情况，用单位面积(1 mm×1 mm)视网膜PEDF阳性细胞数反映PEDF mRNA在视网膜的定量表达;与阴性对照片相比，判定着色部位的阳性反应强度(阳性度)反映PEDF的定性表达。按照阳性反应部位(胞浆)为浅黄色、黄色、棕黄色、褐色分为 +、++、+++、++++四个等级。

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件包进行t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CON1组和DM1组大鼠各指标检测结果

DM1组视网膜血管铺片可见:低倍镜下可见较完整的血管网。高倍镜下可见毛细血管由周细胞及内皮细胞组成，周细胞核小呈圆形，多位于毛细血管一侧;内皮细胞核较大，呈椭圆形或不规则形，长轴与毛细血管平行，一般位于毛细血管中央部位，未见到有闭塞的毛细血管(图1)。周细胞数:CON1组6.45 ±0.64，DM1 组6.52 ±0.75，差异无统计学意义(P＞0.05)。原位杂交染色结果表明:PEDF mRNA在节细胞层、内核层及视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)层均有表达(图2)，PEDF mRNA阳性细胞数:DM1组53±8，与CON1组(64±10)相比，差异无统计学意义(t=2.342，P ＞0.05)。

2.2 CON3组与DM3组大鼠各指标检测结果

DM3组视网膜血管铺片可见:毛细血管迂曲，走行不规则，毛细血管管腔粗细不一。DM3组周细胞数(6.06 ±0.65)较 CON3 组(6.51 ±0.70)减少(P ＜0.05)。原位杂交染色结果表明:PEDF mRNA在节细胞层、内核层、RPE层阳性反应细胞数减少，DM3组为49±12，与CON3组(68±11)相比，差异有统计学意义(t=3.213，P ＜0.05)。

2.3 CON6组与DM6组大鼠各指标检测结果

DM6组视网膜血管铺片可见:视网膜血管形态改变程度严重，可见退化中较长的毛细血管，管腔为闭锁状(图3)。DM6 组周细胞数(5.45 ±0.80)较 CON6 组(6.47 ±0.60)明显减少，差异有统计学意义(P ＜0.05)。原位杂交染色结果表明:PEDF mRNA在内核层和节细胞层阳性反应细胞数减少更显著(图4)，RPE层只见极少阳性细胞表达，CON6组58±8，与DM6组(34±14)相比，差异有显著统计学意义(t=4.099，P ＜0.01)。

3 讨论

视网膜毛细血管主要由周细胞和内皮细胞组成，周细胞和内皮细胞的功能完整对维持视网膜毛细血管的稳定性十分重要。研究表明，毛细血管周细胞可能是一种多功能前体细胞，在合适生理或病理条件下能分化成其他间质细胞［5］(如平滑肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞和巨噬细胞等)。周细胞具有调节内皮细胞增殖、新生血管生长、毛细血管血流、通透性及稳定性等多种功能［6-7］。有研究表明［8］，周细胞与DR的发生、发展密切相关。DR是以微血管病变以及新生血管形成为主要标志的疾病。从形态学角度观察微血管变化的方法很多，其中视网膜血管消化铺片是较好的一种方法。血管新生主要靠内皮细胞的增殖来实现，但受周围环境影响较大，如周细胞及细胞间质等。DR病变早期的形态学变化之一是周细胞数量减少，这曾被认为是DR发病的一个始动因素。因为周细胞含有类似于平滑肌结构的肌动蛋白微丝——Actin，它是一种参与细胞分化、连接和运动的骨架蛋白，具有收缩功能，对维持视网膜血管的正常舒缩、血流量调节具有特殊意义。周细胞对血管活性调节因子的反应可能与早期DR有关。本实验观察到周细胞数量随着STZ大鼠的病程而改变，CON1与DM1组差异无统计学意义，而此时PEDF mRNA已开始表达。随着病程延长，DM3组和DM6组周细胞数量开始较对照组减少，PEDF mRNA阳性反应细胞数减少。这说明周细胞数量减少与PEDF分泌减少有一致性，原因可能是高糖造成视网膜血管周细胞凋亡，其对血管收缩功能及调节血流量的功能下降，同时慢性持续的高糖也可诱发血流的改变及血液流变学异常。随着糖尿病病程的延长，视网膜血流的减少导致视网膜缺血进而引起PEDF分泌减少，促进了DR的新生血管产生。

Figure 1 Photograph of PAS staining of diabetic rat’s retina in 1 month(DM1).It was found that the retinal capillary caliber is regularity(PAS，×400).图1 DM1组:视网膜血管消化铺片PAS染色结果，可见视网膜毛细血管管径粗细均一(PAS，×400)。

Figure 2 Photograph of in situ hybridization of PEDF of DM1.The PEDF mRNA positive expression appeared in ganglion cell layer and inner nuclear layer and RPE layer(DAB，×200).图2 DM1组:PEDF原位杂交染色结果，PEDF mRNA在节细胞层、内核层及RPE层均有表达(DAB，×200)。

Figure 3 Photograph of PAS staining of diabetic rat’s retina in 6 month(DM6).It was found that the acellular capillary appeared in DM6(white arrow，PAS，×400);图3 DM6组:视网膜血管消化铺片PAS染色结果，可见无细胞毛细血管形成(白箭头，PAS，×400)。

Figure 4 Photograph of in situ hybridization of PEDF of DM6.The PEDF mRNA positive expression appeared only in ganglion cell layer and inner nuclear layer(DAB，×200)图4 DM6组:PEDF原位杂交染色结果，PEDF mRNA仅在节细胞层和内核层有表达(DAB，×200)

PEDF是1989年Tombran-Tink等最初从胎儿RPE细胞培养液中分离出来的，具有神经保护作用。Dawson等［9］发现PEDF存在于角膜、玻璃体等眼内组织无血管组织内，推测其具有很强的抑制血管作用，他们将视网膜母细胞瘤细胞放在含体积分数0.5%氧气的低氧环境中，低氧使 VEGF升高9.5倍、而PEDF降低11.8倍左右。国外有学者用酶联免疫吸附法测定经玻璃体切割术后玻璃体中PEDF含量，其中增殖性 DR 为(0.88 ±0.21)g·L-1，非增殖性 DR 为(2.43 ±0.37)g·L-1，这表明 PEDF 抑制新生血管生成，其含量减少可减弱其抑制的缺血缺氧状态下新生血管形成的作用。

综上所述，在DR进展中，周细胞数量减少，视网膜血管发生改变，视网膜缺血缺氧，导致PEDF分泌减少，但血管的这些异常改变是否仅与周细胞减少及PEDF分泌减少有关尚需进一步研究。同时PEDF具有高效的抗血管生成活性［10-11］，成为治疗血管增生性疾病的候选药物。在视网膜的一些致盲眼病中，视网膜新生血管是一个重要危险因素。用PEDF抑制视网膜新生血管的形成，从而控制疾病的发展，成为最近眼科领域研究的一个热点。

1 Oliveira CM，Cristóvão LM，Ribeiro ML，Abreu JR.Improved automated screening of diabetic retinopathy［J］.Ophthalmologica，2011，226(4):191-197.

2 Zheng Z，Chen H，Ke G，Fan Y，Zou H，Sun X，et al.Protective effect of perindopril on diabetic retinopathy is associated with decreased vascular endothelial growth factor-to-pigment epithelium-derived factor ratio:involvement of a mitochondria-reactive oxygen species pathway［J］.Diabetes，2009，58(4):954-964.

3 Shen X，Xie B，Cheng Y，Jiao Q，Zhong Y.Effect of pigment epithelium derived factor on the expression of glutamine synthetase in early phase of experimental diabetic retinopathy［J］.Ocul Immunol Inflamm，2011，19(4):246-254.

4 张惠蓉.眼微循环及相关疾病［M］.北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1993:19-21.

5 Verbeek MM，Otte-Höller I，Wesseling P，Ruiter DJ，de Waal RM.Induction of alpha-smooth muscle actin expression in cultured human brain pericytes by transforming growth factor-beta 1［J］.Am J Pathol，1994，144(2):372-382.

6 Adachi T，Aida K，Nishihara H，Kamiya T，Hara H.Effect of hypoxia mimetic cobalt chloride on the expression of extracellular-superoxide dismutase in retinal pericytes［J］.Biol Pharm Bull，2011，34(8):1297-1300.

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8 Adachi T，Yasuda H，Aida K，Kamiya T，Hara H，Hosoya K，et al.Regulation of extracellular-superoxide dismutase in rat retina pericytes［J］.Redox Rep，2010，15(6):250-258.

9 Dawson DW，Volpert OV，Gillis P，Crawford SE，Xu H，BenedictW，et al.Pigment epithelium derived factor apotent inhibitor of angiogenesis［J］.Science，1999，285(5425):245-248.

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11 Zhang Y，Han J，Yang X，Shao C，Xu Z，Cheng R，et al.Pigment epithelium-derived factor inhibits angiogenesis and growth of gastric carcinoma by down-regulation of VEGF［J］.Oncol Rep，2011，26(3):681-686.