真菌性角膜炎临床转归与病理分析

孙 毅 鲜依鲆 曾 妮 唐 静 邓应平

真菌性角膜炎是一种致盲率极高的感染性角膜病，在热带地区以及从事农业人口较多的地区发病率较气候适宜的地区高［1］，植物性外伤是导致真菌性角膜炎的主要诱因。

刘敬等［2］利用动物模型发现不同真菌在角膜内的生长方式不同，为手术方式的选择提供了组织学基础，但在人眼上是否表现一致还没有确切的定论。激光角膜共焦显微镜用来早期诊断真菌性角膜炎［3］，但用于菌丝浸润深度定位的可靠性未经临床证实。真菌性角膜炎治疗的关键是早诊断、早治疗，板层角膜移植术 (lamellar keratoplasty，LKP)因其供体来源较多，术后免疫排斥反应少见，并不会增加复发的风险［4］，因而得到广泛应用。如何通过术前检查判断真菌浸润深度、分析真菌可能的生长方式，从而判断预后、指导LKP是本研究的主要方向。

1 资料与方法

1.1 研究对象 四川大学华西医院眼科收治的真菌性角膜炎患者31例(31眼)，男14例(14眼)，女17例(17眼)，年龄30～80(50.97±11.41)岁，病程6 ～90 d。

1.2 方法

1.2.1 术前检查 术前常规进行视力检查、眼部裂隙灯检查、眼前节照相、记录病史，观察记录各项临床体征;对所有患眼进行激光角膜共焦显微镜检查(HRTⅡ)，由浅到深，发现菌丝后采集图像，记录最后一张发现菌丝的扫描深度，即共焦深度。将所有术前检查结果按照下列标准分级(表1)。

表1 临床特点分级标准Table1 Standard of clinical classification

1.2.2 治疗方法 入院后进行抗真菌治疗，根据患者病情进展、药物治疗情况选择手术方式:(1)LKP:药物治疗后病情稳定，前房积脓明显减少，共焦深度在300 μm(包含300 μm)下者。(2)结膜瓣遮盖术/眼球内容物摘除术:病情重，药物治疗无好转，共焦深度在300 μm以上者。

所有患者手术中切除的病变角膜进行病理检查(HE染色、PAS染色以及六氨银染色)，观察菌丝浸润深度，即病理深度。

1.2.3 观察指标 观察所有患者的临床评分、共焦图像特点、病理切片染色、详细临床转归情况。

1.2.4 数据分析 获得所有资料后，对于共焦深度与病理深度的一致性检验采用Kappa检验;对于临床特点、共焦深度、病理形态的相关性分析，根据因变量类型分别采取多元线性回归和单因素Logistic回归;对临床特点、共焦深度、病理形态与临床转归的分析采用卡方检验，所有分析采用SPSS 17.0软件包完成。

2 结果

2.1 临床表现 31例患者发病时间在6～90 d，角膜中央或旁中央可见大小不等的灰白色溃疡灶、不同程度前房积脓。

2.2 共焦显微镜检查 一般改变:菌丝高反光、可有分支，呈树枝状、直线状或短棒针状，分布紊乱，走行扭曲无规则，孢子的检出率较低。

共焦深度分布:平均深度(202.58±150.65)μm，31例受检眼中，13例(42%)菌丝深至浅基质层(＜150 μm)，12 例(39%)至中基质层(150 ～300 μm)，6 例(19%)至深基质层(＞300 μm)。

2.3 病理检查 一般病理改变:可见不同程度角膜上皮缺损，炎性细胞浸润，角膜基质纤维不同程度水肿。病理深度分布:平均病理深度(261.29±150.95)μm，31例受检眼中，12例(39%)菌丝深至浅基质层(＜150 μm)，10例(32%)至中基质层(150～300 μm)，9 例(29%)至深基质层(＞300 μm)。病理形态:(1)水平生长:31例受检眼中，22例(71%)角膜组织中可见大部分真菌在角膜基质层平行于板层纤维生长;(2)垂直生长:9例(29%)可见大部分真菌垂直于板层纤维生长，可深达后弹力层(图1)。

Figure 1 Pathological photograph of fungal keratitis.A:Fungal was growing to medial stroma，and grew in corneal layer horizontally(PAS，×200)B:Fungal was growing to superficial stroma，and grew in corneal layer horizontally(methenamine silver stain，×400)C:Fungal was growing to deep stroma layer，and grew in corneal layer vertically(HE，×200)D:Fungal was growing to deep stroma layer vertically(HE，×400) 真菌性角膜炎病理图片染色结果。A:真菌菌丝浸润至中基质层，菌丝在角膜板层内多呈水平生长(PAS，×200);B:真菌菌丝浸润至浅基质层，菌丝在角膜板层内多呈水平生长(六氨银染色，×400);C:真菌菌丝浸润至深基质层，菌丝在角膜板层内呈垂直生长(HE，×200);D:真菌菌丝浸润至深基质层，菌丝在角膜板层内呈垂直生长(HE，×400)

2.4 临床转归 31例患者进行抗真菌药物治疗后根据病情选择手术:27例行LKP，4例患者行眼球内容物摘除术，控制炎症，等待行2期义眼台植入术。27例LKP患者，术后复发3例:其中2例于术后1周内复发，在药物无法控制后行第2次手术，分别行结膜瓣遮盖术与眼球内容物摘除术，另外1例术后1个月出现复发迹象，药物控制良好。

观察最终行眼球内容物摘除术或结膜瓣遮盖术的6例预后差的患者临床特点、共焦深度、病理形态，发现6例患者在溃疡灶直径、前房积脓、共焦深度、病理形态4个变量中分布大多一致，初步推断该4项与真菌性角膜溃疡预后相关。

LKP术后复发的3例患者病程不等，溃疡灶直径均＞4 mm，共焦深度均＞150 μm，均为垂直生长。病理切片发现:2例患者切除病灶的边缘处，基底部未见残余菌丝;1例患者边缘处可见少量残余菌丝。

2.5 临床特点、共焦深度、病理深度的相关分析

2.5.1 共焦深度与病理深度 将所有患者术前共焦显微镜、术后病理切片观察得到的两组菌丝深度数据进行Kappa指数检验，结果见表2(P=0.000)。

表2 两组菌丝深度数据Kappa指数检验结果Table2 Result of Kappa index of fungal depth in two groups

由此可以认为，共焦深度与病理深度对于菌丝浸润深度的定位具有较好的一致性，而共焦深度作为计量资料在统计分析中有较好的精确性，故在以下分析中，将共焦深度数值作为菌丝浸润深度进行研究。

2.5.2 临床特点与共焦深度的相关分析 对所有患者临床每个变量与共焦深度进行单变量回归分析，结果纳入溃疡灶直径、前房积脓此两变量(P＜0.05)。因共焦深度为连续性变量，采取多元线性回归分析，最终分析结果见表3。

表3 临床特点与共焦深度回归分析结果Table3 Linear analysis between clinical signs and confocal depth

由表3可见，采用三种方法最终纳入模型的只有“前房积脓”一个临床变量，并证明与共焦深度存在回归关系:Y=58.816+101.289 X，其中，Y为共焦深度，X为前房积脓，即前房积脓每增加一个等级，共焦深度就增加160.105 μm。

2.5.3 临床特点与病理形态的相关分析 建立Logistic回归模型，针对每个临床变量进行单因素Logistic回归分析，具体检验结果见表4。

表4 病理形态的相关因素单因素Logistic回归分析结果Table4 Univariate logistic regression results of correlation factors of pathological form

由表4看见，临床特征中只有前房积脓与病理形态具有回归关系(P=0.016)。此处OR值(似然比)为正数，比数比为4.047，即前房积脓大一等级，则病理形态垂直者可能是病理形态是水平者的4.047倍。

2.6 对临床转归的分析 对预后较差的患者各项指标观察并初步推测溃疡灶直径、前房积脓、共焦深度、病理形态4个指标与真菌性角膜溃疡预后有相关性。故将此4个指标分别作为单变量与预后进行分析，卡方检验结果示前房积脓、共焦深度、病理形态与预后有着明显的相关性(均为P＜0.05，见表5)，不能认为溃疡灶直径与预后有相关性。

进一步对前房积脓、共焦深度、病理形态与预后作逐步分级的检验，计算OR值，结果示OR值均为正数，结合临床可认为前房积脓越多，共焦深度越深，病理形态为垂直的可能性越大，预后差的可能性越大。

表5 各变量与预后的卡方检验结果Table5 Results of chi square test(Fisher’s Exact Test)of each variable and prognosis

3 讨论

真菌性角膜炎是与植物性外伤史有关的一种严重感染性角膜病，近年来发病率明显增加［5］。刘敬等［2］进行动物实验研究发现不同真菌生长方式不同，由此应考虑不同的治疗方式，传统的药物治疗常用两性霉素B和那他霉素，为镰刀菌、曲霉菌的首选药［6-8］。LKP因其保留了后弹力层与内皮层，同传统的穿透性角膜移植术相比，减少了排斥反应的可能性，而且其角膜供体来源广泛，可以及时进行手术。研究表明真菌性角膜炎患者早期手术治疗有助于术后视力恢复［9］。

谢立信等［10］将真菌性角膜炎按临床特征分型，提出应针对不同生长形态选择行LKP或穿透性角膜移植术。术前判断溃疡灶的深度以及真菌在角膜内生长形态是水平还是垂直，对指导手术方式的选择具有重要意义。

激光共焦显微镜作为一种非侵入性、无创的检查方式，对真菌性角膜炎和细菌性角膜炎可进行鉴别诊断［11］。本研究中真菌性角膜炎在共焦显微镜下的图像形态与国内张军等［12］的分类基本相符，但总体来说，菌丝的分布、形态、走向仍是无规律的，Kappa检验证明激光共焦显微镜检查用于定位菌丝浸润深度的可靠性较好。

传统的观点认为真菌性角膜炎出现前房积脓不宜行LKP，本研究发现，前房积脓越深，菌丝浸润深度就越深、真菌为垂直生长的可能性就越高。但本研究多例前房不同程度积脓的患者在术前经过正规药物抗真菌治疗后，顺利行LKP，术后恢复好，与国内报道相符［13］。

目前早期药物治疗后行LKP是根治真菌性角膜炎最有效的方法，故在术前准确判断患者是否适合行LKP是成功治愈真菌性角膜溃疡的关键步骤。本研究对所有患者临床转归的观察和统计发现前房积脓的程度、菌丝浸润深度、真菌生长的形态影响预后的好坏。

根据对所有患者临床转归的观察以及统计学分析，推断真菌性角膜炎预后差的相关因素:(1)前房积脓＞2 mm;(2)菌丝浸润深度＞300 μm;(3)真菌生长形态为垂直生长。结合临床实际，若真菌性角膜炎患者具有以上3个条件中的至少任何1个，提示该患者预后差的可能性增大。

对行LKP术后复发的3例患者进行分析，发现3例患者均具有下列特点:(1)溃疡灶直径＞4 mm;(2)菌丝浸润深度＞150 μm;(3)真菌生长形态为垂直生长。若术前检查发现患者具有以上3个特点，行LKP术后复发的可能性增大。

本研究中3例垂直生长型真菌性角膜炎行LKP，术后恢复良好，说明LKP也可用来治疗垂直生长型真菌性角膜溃疡，这在早期的临床报道中也不乏见［14］。虽然真菌是水平生长或垂直生长对是否可行LKP并无绝对决定性的作用，但在本研究中也证明垂直生长型患者行LKP复发的可能性较大，故临床医师对待前房积脓＞2 mm患者，应结合其他相关指标，如溃疡灶直径和菌丝浸润深度，慎重考虑其LKP的可行性。

因此，临床医师可通过对真菌性角膜溃疡的临床、共焦显微镜检查来帮助推测真菌生长形态，进而判断预后、LKP可行性，提高LKP的成功率，减少复发。

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