氨溴索对百草枯中毒大鼠肺组织损伤NF-κB和细胞凋亡的影响

马玉腾，刘建辉，苏建玲，郭宪立，高恒波，姚冬奇

（1.河北医科大学第二医院急诊科，河北石家庄 050000；2.河北省人民医院输血科，河北石家庄 050031）

氨溴索对百草枯中毒大鼠肺组织损伤NF-κB和细胞凋亡的影响

马玉腾1，刘建辉2，苏建玲1，郭宪立1，高恒波1，姚冬奇1

（1.河北医科大学第二医院急诊科，河北石家庄 050000；2.河北省人民医院输血科，河北石家庄 050031）

目的探讨氨溴索（ambroxo1，AT）对百草枯（paraquat，PQ）中毒大鼠急性肺损伤中性粒细胞（po1ymorphonuc1ear neutrophi1，PMN）凋亡的影响。方法随机将108只大鼠分为4组，正常对照组（C组）、AT对照组（AT组）、急性肺损伤组（PQ组）和急性肺损伤+AT干预组（PQ+AT组）。取肺组织HE染色来评价肺组织损伤情况；ELISA检测血清中白细胞介素-8（inter1eukin-8，IL-8）水平；免疫细胞化学方法检测支气管肺泡灌洗液（bronchoa1veo1ar 1avage f1uid，BALF）中PMN的核因子-κB（nuc1ear factor kappa B，NF-κB）p65表达；Western B1ot分析定量检测PMN中胞浆蛋白IκBα的含量；流式细胞仪检测PMN凋亡率。结果C组和AT组大鼠的肺组织结构基本完整；PQ组炎性细胞浸润明显增多；肺组织损伤程度加重。PQ+AT组肺组织损伤程度较轻。PQ组血清IL-8水平较C组显著增加（P＜0.01），PQ+AT组较PQ组降低，较C、AT组高（P＜0.01）。PQ中毒能够引起BALF中PMN的NF-κB亚基p65核易位和PMN胞浆蛋白IκBα的降解，AT对此具有抑制作用。PQ组3d时PMN的凋亡率最低，PQ+AT组相应时间点与PQ组相应时间点相比凋亡率均增加（P＜0.05）。结论PQ中毒导致了大鼠急性肺损伤，经AT治疗后，使延缓的PMN凋亡恢复正常，从而有效地减轻了PQ中毒所致的大鼠急性肺损伤。

百草枯；肺；大鼠

百草枯（paraquat，PQ）属灭生型高毒性除草剂，若误服中毒吸收快，对人及动物有极高的肺毒性。PQ中毒早期可造成急性肺损伤（acute 1ung injury，ALI）或急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），目前尚无有效的治疗方法［1］，患者多死于多脏器功能衰竭或呼吸衰竭，其发病机制尚不十分清楚。本研究通过观察PQ中毒大鼠所致的肺损伤，初步探讨PQ中毒所致大鼠ALI时大剂量氨溴索（ambroxo1，AT）是否通过对中性粒细胞（po1ymorphonuc1ear neutrophi1，PMN）凋亡的影响而干预大鼠肺组织损伤。

1 材料与方法

1.1 动物分组及处理：健康雄性SD大鼠108只，7～8周龄，体质量250～300g，购自河北医科大学实验动物中心。随机将大鼠分为4组。①正常对照组（C组，18只），腹腔注射生理盐水3mL/kg；②AT对照组（AT组，18只），腹腔注射AT 35mg/kg；③ALI组（PQ组，36只），大鼠腹腔注入 2% PQ液（25mg/kg，英国捷利康有限公司提供）制作PQ中毒ALI模型；④ALI+AT干预组（PQ+AT组，36只），染毒后腹腔注射AT（35mg/kg），每天同一时间注射。后2组又分别以腹腔注射PQ后的1、3、5d作观测点，处死动物、取材，每个时间点12只大鼠。

1.2 血浆白细胞介素-8（inter1eukin-8，IL-8）水平的测定和肺组织HE染色：实验开始后第1、3、5天处理大鼠，首先取静脉血离心，将血清置-70℃冰箱保存，待测IL-8。ELISA方法操作严格按照说明书进行。肺组织取材后，常规HE染色。

1.3 大鼠支气管肺泡灌洗液（bronchoa1veo1ar 1avage f1uid，BALF）中 PMN的分离：收集支气管BALF后离心留取上清备用，沉淀重新悬浮后，进行密度梯度离心，PMN富集层进行瑞氏-姬姆萨染色，PMN纯度＞88%方可进行下一步实验。

1.4 免疫细胞化学检测 PMN的核因子 -κB（nuc1ear factor kappa B，NF-κB）亚基p65核易位：一抗采用兔抗NF-κB p65多抗，相应生物素标记的第二抗体及辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒。阴性对照用PBS代替一抗。体积较小且核分叶的细胞为PMN。操作过程按试剂盒说明书进行。

1.5 采用Western B1ot分析定量检测PMN胞浆蛋白中IκBα的含量：一抗采用兔抗IκBα多抗。

1.6 流式细胞仪检测PMN凋亡率：BALF中提纯的PMN悬液经碘化丙啶（propidium iodide，PI）染料避光染色10min后，上流式细胞仪，染色阳性为凋亡细胞。

1.7 统计学方法：应用SPSS11.5统计软件进行统计分析，计量资料以±s表示，分别采用t检验、方差分析及q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肺组织损伤情况：C组、AT组大鼠的肺组织结构完整，无炎症细胞渗出。PQ组肺间隔增厚，肺泡壁断裂，大量PMN等炎症细胞浸润，且随时间的延长炎性细胞浸润增多，肺组织损伤程度加重。PQ+ AT组肺组织有同PQ组相似的病理表现，但对应时间点肺组织损伤程度较轻（图1）。

图1 3组大鼠肺组织损伤情况（HE×200）A.C组；B.PQ组；C.PQ+AT组Figure 1 The injury of 1ung tissue in rats of three groups（HE ×200）A.Group C；B.Group PQ；C.Group PQ+AT

2.2 血清IL-8水平：血清IL-8水平PQ组较C组和AT组显著增加（P＜0.01），而PQ+AT组较PQ组降低（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠血清IL-8水平Table 1 The expression of IL-8 in the serum of each group of rats（±s，ρ/ng·L-1）

表1 各组大鼠血清IL-8水平Table 1 The expression of IL-8 in the serum of each group of rats（±s，ρ/ng·L-1）

*P＜0.01 vs the other three groups by q testAT：ambroxo1；PQ：paraquat

Groups n IL-8 1d 3d 5d C 18 39.42±8.35 25.20±3.58 29.85±5.12 AT 18 24.59±2.87 28.54±2.91 21.56±3.62 PQ 36 725.98±66.43* 885.87±85.18*794.60±76.36*PQ+AT 36 395.23±40.24* 385.84±45.57*312.88±33.62*

2.3 免疫细胞化学结果：PQ中毒能够引起BALF中PMN的NF-κB亚基p65核易位，即棕黄色阳性信号位于胞核，AT对此具有抑制作用，阳性信号位于胞浆中。见图2。

图2 2组大鼠免疫组织化学结果（ ×400）A.PQ组；B.PQ+AT组Figure 2 The resu1ts of immunocytochemistry in rats of two groups（ × 400）A.Group PQ；B.Group PQ+AT

2.4 Western B1ot结果：PQ中毒后引起PMN胞浆蛋白中IκBα的降解，AT对此具有抑制作用。见图3。

图3 3组大鼠IκBα Western B1ot结果*P＜0.01与C组比较 #P＜0.01与PQ组比较（t检验）Figure 3 The IκBα resu1ts of Western B1ot in rats of three groups*P＜0.01 vs group C #P＜0.01 vs group PQ by t test

2.5 BALF中PMN的凋亡率：C组与AT组比差异无统计学意义（P＞0.05）；PQ组各时间点PMN的凋亡率（1、3、5d）均较C组降低（P＜0.05），其中3d时PMN的凋亡率最低，此时细胞寿命最长（P＜0.05）；PQ+AT组各时间点（1、3、5d）与PQ组相应时间点相比凋亡率均增加（P＜0.05），但与C组和AT组相比，PMN的凋亡率仍较低（P＜0.05）。见表2。

表2 BALF中各组PMN的凋亡率Table 2 The rate of PMN apoptosis in BALF of each group of rats（%）

3 讨 论

本实验观察到，腹腔注射2%PQ液1d后，大鼠呼吸加快、窘迫，口唇及趾端明显发绀，其病理组织学改变已达到ALI的标准，可以作为PQ中毒ALI的动物模型用于实验研究。大鼠PQ中毒后1d，即出现较严重的肺组织损伤，3d时肺组织损伤最严重［2］。

ALI的特点是肺泡毛细血管屏障的损伤，PMN的积累以及促炎性细胞因子的诱导。其中PMN在ALI时发挥了至关重要的作用［3-4］，它们是宿主抗感染机制的第一反应。本实验发现腹腔注射PQ的确引起了BALF中PMN大量浸润。在炎症过程中凋亡调控着PMN数量和反应性，保持炎症反应的适度水平。这种凋亡和清除间的动态平衡既防止了PMN的过度过量激活加重炎症反应，又能够避免凋亡的PMN继发性坏死释放毒性内容物，加重周围组织损伤［5］。ALI时PMN的凋亡发生延迟，PMN的寿命和损伤组织的时间将会延长。已有临床资料表明PMN寿命的延长，继而持续分泌炎症介质与ARDS的发生率和病死率均呈正相关关系［6］。本实验采用流式细胞仪检测BALF中PMN的凋亡，证实PQ中毒所致大鼠ALI后PMN凋亡延迟，提示PMN凋亡延迟可能是ALI引起PMN在肺内大量聚集、浸润、持续发挥作用。

IL-8是一种强而有力的PMN趋化和活化因子，其生物学作用是趋化并激活PMN，使PMN外型改变，促使其脱颗粒；激活PMN并使其产生呼吸爆炸，促进PMN的溶酶体酶活性和吞噬作用，同时对嗜碱性粒细胞和T细胞也有一定的趋化作用，IL-8水平升高与PMN、淋巴细胞升高相一致，IL-8有可能作为炎症反应与肺损伤严重性的早期标志。

NF-κB作为一种重要的核转录因子，在非活化状态下，NF-κB存在于静止期细胞胞浆，是p50、p65与抑制蛋白IκB结合的多聚体［7］。NF-κB的激活在多种细胞起着抑制凋亡，延长生存时间。PQ中毒后大量NF-κB被刺激活化［8-9］，与IκB分离而进入细胞核，进而参与下游炎症因子的转录和翻译，诱导炎症反应。我们采用免疫细胞化学方法检测BALF细胞涂片PMN中的NF-κB p65亚基的核易位，发现腹腔注射PQ引起PMN中的NF-κB p65亚基核易位，而AT对此具有明显的抑制作用。

AT是一种具有多种生物学效应的黏液溶解剂。近年来有研究显示，大剂量AT可减少超氧阴离子及H2O2等的生成，减轻肺氧化性损伤［10］；减少多种炎症细胞及炎症介质的释放，减轻过度炎症反应所引起的肺破坏作用。大剂量AT具有一定的抗炎、抗氧化的作用，对于PQ中毒有明显的治疗作用［11］。我们的实验结果首次在整体水平发现AT通过抑制NF-κB促进PMN凋亡，这也是AT对抗PQ所致ALI的重要机制之一。

本实验通过探讨NF-κB信号转导通路的多个环节在调控PMN凋亡中的作用，可为临床防治炎症性疾病提供新的思路。因而采取有效措施进行干预，适时适度清除不需要的、处于持续激活状态的PMN，对于控制炎症反应的发展和转归至关重要，从而为临床治疗ALI提供理论依据，为开拓新的治疗思路提供参考。

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（本文编辑：赵丽洁）

EFFECTS OF AMBROXOL ON NF-κB AND CELL APOPTOSIS IN LUNG INJURY ASSOCIATED WITH PARAQUAT POISONING OF RATS

MA Yuteng1，LIU Jianhui2，SU Jian1ing1，GUO Xian1i1，GAO Hengbo1，YAO Dongqi1
（1.Department of Emergenct Medicine，the Second Hospital of Hebei Medical Universitt，Shijiazhuang 050000，China；
2.Department of Blood Transfusion，the Hebei Province Peopleˊs Hospital，Shijiazhuang 050051，China）

ObjectiveTo investigate the effects of ambroxo1（AT）on nuc1ear factor kappa B（NF-κB）and po1ymorphonuc1ear neutrophi1（PMN）apoptosis in 1ung injury associated with paraquat（PQ）poisoning of rats.MethodsA tota1 of 108 rats were random1y divided into four groups：contro1 group，group AT，group PQ and group PQ+AT.Lung tissue was stained with hemotoxy1in and eosin（HE）to eva1uate the patho1ogica1 change.The 1eve1 of inter1eukin-8（IL-8）in serum was detected by ELISA.The expression of NF-κB p65 in PMN of bronchoa1veo1ar 1avage f1uid（BALF）was determined by using immunohistochemisca1 method.The content of IκBα of cytop1asm protein was determined by Western B1ot ana1ysis.The ratio of PMN apoptosis was assayed by f1ow cytometry.ResultsThe structure of 1ung tissue was integrated in group C and group AT.Inf1ammatory ce11 infi1tration increased obvious1y and the degree of 1ung injury was severe in group PQ；The degree of 1ung injury was 1ighter in group PQ+ AT.The content of IL-8 in group PQ was significant1y higher than that of group C（P＜0.01）.The content of IL-8 in group PQ+AT was 1ower than that of group PQ，and higher than that of group C andAT（P＜0.01）.Paraquat poisoning caused NF-κB subunit p65 trans1ocation and IκBα degradation in PMN of BALF.Ambroxo1 had inhibitory effect on these changes.The ratio of PMN apoptosis in group PQ was the 1owest on the third day.The ratio of PMN apoptosis in group PQ+AT was higher than that of group PQ on corresponding time（P＜0.05）。ConclusionParaquat poisoning can 1ead to acute 1ung injury in rats.After using ambroxo1（AT），the process of PMN apoptosis regain norma1 and 1ighten the 1ung injury associated with paraquat poisoning of rats.

paraquat；1ung；rats

R563.9

A

1007-3205（2012）04-0421-04

2011-12-06；

2012-03-09

河北省科学技术攻关计划项目（0520611034D-6）

马玉腾（1966-），男，河北景县人，河北医科大学第二医院副主任医师，医学硕士，从事急诊医学诊治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.04.018